تصور وظيفة الجهاز التنفسي الميتوكوندريا باستخدام السيتوكروم C أوكسيديز / سكسينات نازعة (كوكس / SDH) مزدوجة وضع العلامات الكيمياء النسيجية
Summary
والسيتوكروم أوكسيديز ج / نازعة الصوديوم (كوكس / SDH) المزدوج الوسم الأسلوب يسمح للرؤية مباشرة من الميتوكوندريا القصور التنفسي الانزيم في أقسام الأنسجة الطازجة المجمدة. هذا هو أسلوب مباشر النسيجية ومفيد في التحقيق في أمراض الميتوكوندريا ، والشيخوخة ، والاضطرابات المتصلة بالشيخوخة.
Abstract
الميتوكوندريا الحمض النووي (و mtDNA) العيوب هي سبب هام للمرض ، وربما تكمن وراء الشيخوخة والشيخوخة ذات الصلة 1،2 التعديلات. نظرية الميتوكوندريا الشيخوخة يشير إلى وجود دور للطفرات و mtDNA ، الذي يمكن أن يغير توازن الطاقة الحيوية والوظيفة الخلوية ، في عملية الشيخوخة 3. وقد تم تجميع ثروة من الأدلة لدعم هذا 1،4 الناحية النظرية ، على سبيل المثال يجري mutator 5 و mtDNA الماوس ، ولكن الدور الدقيق للضرر و mtDNA في الشيخوخة ليست مفهومة تماما 6،7.
مراقبة نشاط الانزيمات التنفسية هو نهج واضحة للتحقيق في ضعف الميتوكوندريا. رابعا معقدة ، أو السيتوكروم أوكسيديز ج (كوكس) ، أمر ضروري من أجل وظيفة الميتوكوندريا. يتم ترميز مفارز الحفاز كوكس و mtDNA والتي تعتبر ضرورية لتجميع المجمع (الشكل 1). وبالتالي ، تستند إلى حد كبير التوليف الصحيح والدالة على سلامة و mtDNA 2.رغم أن من الممكن تحقيق المجمعات التنفسية الأخرى ، المجمعات الرابع والثاني هم الأكثر قابلية للفحص النسيجية 8،9. يتم ترميز معقدة تماما الثاني ، أو نازعة سكسينات (SDH) ، عن طريق الحمض النووي (الشكل 1) ، وعادة ما يكون نشاطها لم تتأثر و mtDNA ضعاف ، على الرغم من زيادة قد تشير إلى نشوء حيوي الميتوكوندريا 10-12. لاحظ و mtDNA ضعف في أمراض الميتوكوندريا ، والشيخوخة ، والأمراض المرتبطة بالعمر وغالبا ما يؤدي إلى وجود خلايا للنشاط COX منخفضة أو غائبة 2،12-14. على الرغم من أن يتم التحقيق كوكس وSDH أنشطة فردية ، أثبتت متتابعة المزدوج وسم 15،16 طريقة ليكون من المفيد في تحديد الخلايا التي تحتوي على ضعف الميتوكوندريا 12،17-21.
وقد تم تحديد العديد من الدساتير الأمثل للمقايسة ، مثل تركيز الركيزة ، يقبلون الإلكترون / المتبرعين والناقلين الإلكترون وسيطة ، وتأثير درجة الحموضة ، والتفاعل طنIME 9،22،23. 3،3 '- diaminobenzidine (DAB) هو المانحة الإلكترون فعالة وموثوق بها 22. في الخلايا التي تحتوي على سير كوكس ، فإن البوليمر الناتج البني indamine توطين في أعراف الميتوكوندريا وتشبع الخلايا 22. وبالتالي فإن هذه الخلايا مع كوكس مختلة لا تكون مشبعة بواسطة المنتج DAB ، والسماح للتصور النشاط SDH بتخفيض tetrazolium nitroblue (NBT) ، والمتقبلة الإلكترون ، إلى منتج الأزرق نهاية formazan 9،24. تضاف السيتوكروم ج سكسينات الصوديوم وركائز لتطبيع المستويات المحلية بين السيطرة والأنسجة المريضة / 9 متحولة. الكاتلاز يضاف كاجراء احترازي لتجنب ردود الفعل المحتملة من تلوث النشاط البيروكسيداز 9،22. يستخدم Phenazine methosulfate (PMS) ، حاملة الإلكترون الوسيطة ، بالاشتراك مع أزيد الصوديوم ، مثبط السلسلة التنفسية ، وزيادة في تشكيل منتجات التفاعل النهائي 9،25. على الرغم من ذلك إبلاغأوجه ، وبعض التفاصيل الهامة التي تؤثر على نتيجة الفحص هذه واضحة لائق ، بالإضافة إلى الضوابط المحددة والتقدم في التقنية ، لم يتم تقديمها حتى الآن.
Protocol
Discussion
مجتمعة كوكس / SDH النسيجية طريقة تمكن من الخلايا التصور مع ضعف الميتوكوندريا. هذه التقنية ، مع دراسات في وقت مبكر يعود إلى عام 1968 ، لا يزال يتمتع بشعبية ، مع العديد من معتبرا انه "المعيار الذهبي" لتحديد أمراض الميتوكوندريا في المرضى 14،19،26،27. الآن أنها كثيرا م?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للشيخوخة (AG04418) ، المعهد الوطني لتعاطي المخدرات ، والمعهد الوطني للصحة من معهد كارولينسكا برنامج الشراكات العليا ، معهد كارولينسكا ، مجلس البحوث السويدية والسويدية كهربائية الدماغ ، والسويدية مؤسسة الدماغ. شكرا جزيلا لKarlen والدكتور ماتياس Coppotelli جوزيبي للحصول على الدعم الخلاق مع الشكل 1 و 2 ، على التوالي ؛ كارين Pernold للحصول على المساعدة التقنية ، والدكاترة. باري ج. هوفر ، لارس أولسون ، ونيلز لارسون ، غوران لنصائح مفيدة كثيرا والمناقشة.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Dry Ice | AGA Gas AB | block form | |
| Isopentane (2-methylbutane) | Sigma-Aldrich | 277258 CAS: 78-78-4 |
|
| Cyrostat embedding solution | Sakura Finetek | Tissue Tek 4583 | |
| Cryostat | Microm | Microm Model HM 500M | |
| Slides | Thermo Scientific | Super Frost Plus Menzel Gläser J1800AMWZ |
|
| Cover glasses Borosilicate glass |
VWR International | 16004-098 | 24 x 50 mm |
| Filter Paper | Munktell Filter AB | Quality: 1350 Article Number: 242 001 |
430 x 430 mm |
| 3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | Sigma-Aldrich | Sigma Liquid Substrate System, D7304 | |
| Cytochrome c (Type III, from equine heart) | Sigma-Aldrich | C2506 CAS: 9007-43-6 |
|
| Bovine catalase (from liver) | Sigma-Aldrich | C9322 CAS: 9001-05-2 |
|
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Sigma-Aldrich | N6876 CAS: 298-83-9 |
|
| Sodium succinate | Sigma-Aldrich | S2378 CAS: 6106-21-4 |
|
| Phenazine methosulfate (PMS) | Sigma-Aldrich | P9625 CAS: 299-11-6 |
PMS is light sensitive. Shield from light. |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 CAS: 26628-22-8 |
|
| Xylene | VWR International | EM-XX0060-4 | |
| Entellan | VWR International | 100503-870 | |
| Malonate (Malonic acid) |
Sigma-Aldrich | M1296 CAS: 141-82-2 |
References
- Larsson, N. G. Somatic mitochondrial DNA mutations in mammalian aging. Annu. Rev. Biochem. 79, 683-706 (2010).
- Cottrell, D. A. Role of mitochondrial DNA mutations in disease and aging. Ann. NY Acad. Sci. 908, 199-207 (2000).
- Harman, D. The biologic clock: the mitochondria. J. Am. Geriatr. Soc. 20, 145-147 (1972).
- Wallace, D. C. Mitochondrial genetics – a paradigm for aging and degenerative diseases. Science. 256, 628-632 (1992).
- Trifunovic, A. Premature ageing in mice expressing defective mitochondrial DNA polymerase. Nature. 429, 417-423 (2004).
- Ameur, A. Ultra-deep sequencing of mouse mitochondrial DNA: mutational patterns and their origins. PLoS Genet. 7, e1002028-e1002028 (2011).
- Safdar, A. Endurance exercise rescues progeroid aging and induces systemic mitochondrial rejuvenation in mtDNA mutator mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4135-4140 (2011).
- DiMauro, S., Bonilla, E., Zeviani, M., Nakagawa, M., DeVivo, D. C. Mitochondrial myopathies. Ann. Neurol. 17, 521-538 (1985).
- Old, S. L., Johnson, M. A. Methods of microphotometric assay of succinate dehydrogenase and cytochrome c oxidase activities for use on human skeletal muscle. Histochem. J. 21, 545-555 (1989).
- Chaturvedi, R. K. Impaired PGC-1alpha function in muscle in Huntington’s disease. Hum. Mol. Genet. 18, 3048-3065 (2009).
- Edgar, D. Random point mutations with major effects on protein-coding genes are the driving force behind premature aging in mtDNA mutator mice. Cell. Metab. 10, 131-138 (2009).
- Ross, J. M. High brain lactate is a hallmark of aging and caused by a shift in the lactate dehydrogenase A/B ratio. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 20087-20092 (2010).
- Crugnola, V. Mitochondrial respiratory chain dysfunction in muscle from patients with amyotrophic lateral sclerosis. Arch. Neurol. 67, 849-854 (2010).
- Nonaka, I. Muscle pathology in cytochrome c oxidase deficiency. Acta. Neuropathol. 77, 152-160 (1988).
- DiMauro, S. Mitochondrial encephalomyopathies. Neurol. Clin. 8, 483-506 (1990).
- Bonilla, E. New morphological approaches to the study of mitochondrial encephalomyopathies. Brain. Pathol. 2, 113-119 (1992).
- Brierley, E. J., Johnson, M. A., Lightowlers, R. N., James, O. F., Turnbull, D. M. Role of mitochondrial DNA mutations in human aging: implications for the central nervous system and muscle. Ann. Neurol. 43, 217-223 (1998).
- Borthwick, G. M., Johnson, M. A., Ince, P. G., Shaw, P. J., Turnbull, D. M. Mitochondrial enzyme activity in amyotrophic lateral sclerosis: implications for the role of mitochondria in neuronal cell death. Ann. Neurol. 46, 787-790 (1999).
- Gellerich, F. N. Mitochondrial respiratory rates and activities of respiratory chain complexes correlate linearly with heteroplasmy of deleted mtDNA without threshold and independently of deletion size. Biochim. Biophys. Acta. 1556, 41-52 (2002).
- Larsson, N. G. Mitochondrial transcription factor A is necessary for mtDNA maintenance and embryogenesis in mice. Nat. Genet. 18, 231-236 (1998).
- Ekstrand, M. I. Progressive parkinsonism in mice with respiratory-chain-deficient dopamine neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 1325-1330 (2007).
- Seligman, A. M., Karnovsky, M. J., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. Nondroplet ultrastructural demonstration of cytochrome oxidase activity with a polymerizing osmiophilic reagent, diaminobenzidine (DAB). J. Cell. Biol. 38, 1-14 (1968).
- Dubowitz, V., Brooke, M. Muscle Biopsy: A Modern Approach. , (1973).
- Cottrell, D. A. Cytochrome c oxidase deficient cells accumulate in the hippocampus and choroid plexus with age. Neurobiol. Aging. 22, 265-272 (2001).
- Blanco, C. E., Sieck, G. C., Edgerton, V. R. Quantitative histochemical determination of succinic dehydrogenase activity in skeletal muscle fibres. Histochem. J. 20, 230-243 (1988).
- Moraes, C. T., Ricci, E., Bonilla, E., DiMauro, S., Schon, E. A. The mitochondrial tRNA(Leu(UUR)) mutation in mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes (MELAS): genetic, biochemical, and morphological correlations in skeletal muscle. Am. J. Hum. Genet. 50, 934-949 (1992).
- Petruzzella, V. Extremely high levels of mutant mtDNAs co-localize with cytochrome c oxidase-negative ragged-red fibers in patients harboring a point mutation at nt 3243. Hum. Mol. Genet. 3, 449-454 (1994).
- Tulinius, M. H., Holme, E., Kristiansson, B., Larsson, N. G., Oldfors, A. Mitochondrial encephalomyopathies in childhood. I. Biochemical and morphologic investigations. J. Pediatr. 119, 242-250 (1991).
- Haas, R. H. The in-depth evaluation of suspected mitochondrial disease. Mol. Genet. Metab. 94, 16-37 (2008).
