시토크롬를 사용 Mitochondrial 호흡 기능의 시각화 C 데이스 / 호박산 탈수소 효소 (COX / SDH)를 두 번 라벨 Histochemistry
Summary
시토크롬 C 산화 효소 / 나트륨 탈수소 효소 (COX / SDH)를 두 번 라벨링 방법은 신선한 – 냉동 조직 섹션에서 mitochondrial 호흡 효소 결함의 직접적인 시각화를위한 수 있습니다. 이것은 간단한 histochemical 기법입니다 mitochondrial 질병, 노화, 그리고 노화 관련 질환을 조사하는 데 유용합니다.
Abstract
Mitochondrial DNA (mtDNA) 결함이 질병의 중요한 원인이며, 변경의 1,2를 노화와 노화 관련 기초 수 있습니다. 노화의 mitochondrial 이론은 노화 3, bioenergetics의 항상성 및 세포 기능을 변경할 수 있습니다 mtDNA 변이에 대한 역할을 제안합니다. 증거가 풍부한이 이론 1,4, mtDNA mutator 마우스 오되는 예제를 지원하도록 컴파일되어 있지만, 노화의 mtDNA 손상의 정확한 역할은 6,7 완전히 이해되지 않습니다.
호흡 효소의 활동을 관찰하는 것은 mitochondrial 장애를 조사하는 간단한 방법입니다. 복잡한 IV 또는 시토크롬 C 산화 효소 (COX)는 mitochondrial 기능에 대한 필수적입니다. COX의 촉매 subunits는 mtDNA에 의해 인코딩과 복잡한 조립 (그림 1) 필수입니다. 그러므로, 적절한 합성과 기능을 크게 mtDNA 무결성 2 기반으로합니다.다른 호흡 단지가 조사 될 수 있지만, 단지 IV와 II는 histochemical 시험 8,9 가장 의무가 있습니다. 증가 mitochondrial biogenesis 10-12을 나타내는 수도 있지만, 복잡한 II, 또는 호박산 탈수소 효소 (SDH)는, 완전히 핵 DNA (그림 1)에 의해 인코딩되어, 그 활동은 일반적으로 장애인 mtDNA에 의해 영향을받지 않습니다. 장애 mtDNA는 노화, mitochondrial 질환에서 관찰하고, 연령 관련 질병은 종종 낮은 값이나 COX 활동 2,12-14과 함께 세포의 존재에 이르게한다. COX와 SDH 활동 개별적으로 조사 수 있지만, 순차적 이중 라벨 부착 방법 15,16은 mitochondrial 장애 12,17-21와 세포를 찾는데 유리한 것으로 입증되었습니다.
분석의 최적의 체질의 대부분은 이러한 기판 농도, 전자 acceptors / 기증자, 중급 전자 통신 사업자, 산도의 영향, 그리고 반응 t으로 결정되었습니다IME 9,22,23. 3,3 '- diaminobenzidine (DAB)은 효과적이고 신뢰할 수있는 전자 기증자 22. COX 기능과 세포에서 갈색 indamine 폴리머 제품은 mitochondrial cristae에 집중하고 세포에게 22 포화 것입니다. 장애 COX있는 사람 세포 따라서 파란색 formazan 엔드 제품 9,24에 nitroblue tetrazolium (NBT), 전자 수용체의 감소에 의한 SDH 활동의 시각화에 대한 허용, DAB 제품에서 포화되지 않습니다. 시토크롬 C와 나트륨 호박산 기판은 제어와 돌연변이 / 병에 걸린 조직 구 사이의 내생적인 수치를 정상화에 추가됩니다. 카탈 라 아제 퍼옥시데이즈 활동 9,22에서 가능한 오염 반응을 피하기 위해 예방책으로 추가됩니다. Phenazine의 methosulfate (PMS), 중간 전자 운반체는 최종 반응 제품 9,25의 형성을 증가 나트륨 azide, 호흡 사슬 억제제와 함께 사용됩니다. 이 통보에도 불구하고ation,이 알맞은 간단 분석의 결과에 영향을 미치는 몇 가지 중요한 세부 사항은, 특이성 컨트롤과 기술의 진보뿐만 아니라, 아직 제시되지 않았습니다.
Protocol
Discussion
통합 COX / SDH histochemical 방법은 mitochondrial 장애와 세포의 시각화 수 있습니다. 이 기법은, 초기 연구는 1968까지 거슬러 올라가는와 함께, 많은이에게 환자 14,19,26,27에서 mitochondrial 질병을 식별에 대한 "황금 표준"을 고려와 함께 인기가 남아있다. 그것은 지금 자주 mtDNA 변이 기반 노화와 노화 관련 질환 12,13,18,20,21,24을 조사하는 데 사용됩니다. COX / SDH 이중 라벨 부착 방법은 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 노화의 국립 연구소 (AG04418), 약물 남용에 국립 연구소, 건강 Karolinska Institutet 연구 협력 프로그램의 국립 연구소, Karolinska Institutet, 스웨덴어 연구위원회, 스웨덴어 브레인 파워, 그리고 스웨덴어 뇌 재단에 의해 지원되었다. 대부분의 각각 그림 1 및 2와 창조에 대한 지원 Mattias Karlen 박사 주세페 Coppotelli 덕분에, 기술 지원 Pernold Karin 및 Drs. 배리 J. Hoffer, 많은 도움이 조언과 토론 라스 올슨, 그리고 닐스 – 고란 라슨.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Dry Ice | AGA Gas AB | block form | |
| Isopentane (2-methylbutane) | Sigma-Aldrich | 277258 CAS: 78-78-4 |
|
| Cyrostat embedding solution | Sakura Finetek | Tissue Tek 4583 | |
| Cryostat | Microm | Microm Model HM 500M | |
| Slides | Thermo Scientific | Super Frost Plus Menzel Gläser J1800AMWZ |
|
| Cover glasses Borosilicate glass |
VWR International | 16004-098 | 24 x 50 mm |
| Filter Paper | Munktell Filter AB | Quality: 1350 Article Number: 242 001 |
430 x 430 mm |
| 3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | Sigma-Aldrich | Sigma Liquid Substrate System, D7304 | |
| Cytochrome c (Type III, from equine heart) | Sigma-Aldrich | C2506 CAS: 9007-43-6 |
|
| Bovine catalase (from liver) | Sigma-Aldrich | C9322 CAS: 9001-05-2 |
|
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Sigma-Aldrich | N6876 CAS: 298-83-9 |
|
| Sodium succinate | Sigma-Aldrich | S2378 CAS: 6106-21-4 |
|
| Phenazine methosulfate (PMS) | Sigma-Aldrich | P9625 CAS: 299-11-6 |
PMS is light sensitive. Shield from light. |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 CAS: 26628-22-8 |
|
| Xylene | VWR International | EM-XX0060-4 | |
| Entellan | VWR International | 100503-870 | |
| Malonate (Malonic acid) |
Sigma-Aldrich | M1296 CAS: 141-82-2 |
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