Visualisering av Mitokondriell lungefunksjon bruker Cytokrom C Oksidase / succinate dehydrogenase (COX / SDH) Double-merking Histochemistry
Summary
Cytokrom c oksidase / natrium dehydrogenase (COX / SDH) dobbel merking metode gjør det mulig for direkte visualisering av mitokondrie luftveiene enzym mangler i fersk-frosset vev seksjoner. Dette er en grei histochemical teknikk og er nyttig i å undersøke mitokondrie sykdommer, aldring og aldring-relaterte lidelser.
Abstract
Mitokondrie DNA (mtDNA) mangler er en viktig årsak til sykdom, og kan ligge til grunn for aldring og aldring-relaterte endringer 1,2. Mitokondrie teori om aldring antyder en rolle for mtDNA mutasjoner som kan endre bioenergi homeostase og cellulære funksjon, i aldringsprosessen 3. Et vell av bevis er utarbeidet til støtte for denne teorien 1,4, et eksempel er den mtDNA mutator musen 5, men er den presise rolle mtDNA skader i aldring ikke helt forstått 6,7.
Observere aktiviteten av respiratorisk enzymer er en grei metode for å undersøke mitokondriell dysfunksjon. Kompleks IV, eller cytokrom c oksidase (COX), er avgjørende for mitochondrial funksjon. Den katalytiske subenheter av COX er kodet av mtDNA og er viktig for montering av komplekset (figur 1). Dermed er riktig syntese og funksjon i stor grad basert på mtDNA integritet 2.Selv om andre respiratoriske komplekser kan bli etterforsket, Komplekser IV og II er mest mottagelig for histochemical undersøkelse 8,9. Complex II, eller succinate dehydrogenase (SDH), er helt kodet av kjerne-DNA (figur 1), og om aktiviteten er vanligvis ikke påvirket av svekket mtDNA, men en økning kan indikere mitochondrial biogenesis 10-12. Den svekket mtDNA observert i mitokondrie sykdommer, aldring og aldersrelaterte sykdommer som ofte fører til tilstedeværelsen av celler med lav eller fraværende COX aktivitet 2,12-14. Selv om COX og SDH aktiviteter kan undersøkes individuelt, har den sekvensielle dobbel merking metode 15,16 viste seg å være en fordel i å finne celler med mitokondriedysfunksjon 12,17-21.
Mange av optimal forfatninger av analysen vært fastsatt, slik som substrat konsentrasjon, elektron akseptorer / givere, middels elektron bærere, påvirkning av pH, og reaksjonen tIME 9,22,23. 3,3 '-diaminobenzidine (DAB) er en effektiv og pålitelig elektron donor 22. I celler med fungerende COX, vil den brune indamine polymer produktet lokalisere i mitochondrial cristae og mette celler 22. Disse cellene med dysfunksjonelle COX vil derfor ikke bli mettet av DAB produktet, noe som åpner for visualisering av SDH aktivitet ved reduksjon av nitroblue tetrazolium (NBT), et elektron akseptor, til en blå formazanforbindelsen sluttprodukt 9,24. Cytokrom c og natrium succinate underlag legges til normalisere endogene nivåer mellom kontroll og syke / muterte vev 9. Catalase legges til som en forholdsregel for å unngå mulig forurensing reaksjoner fra peroksidase aktivitet 9,22. Phenazine methosulfate (PMS), en mellomliggende elektron carrier, brukes i forbindelse med natriumazid, en respiratoriske kjede hemmer, for å øke dannelsen av den endelige reaksjonen produktene 9,25. Til tross for dette informereasjon, noen kritiske detaljer som påvirker resultatet av denne høvisk enkle analysen, i tillegg til spesifisitet kontroller og fremskritt i teknikken, ennå ikke har blitt presentert.
Protocol
Discussion
Den kombinerte COX / SDH histochemical metoden muliggjør visualisering av cellene med mitokondriell dysfunksjon. Denne teknikken, med tidlige studier som kan dateres tilbake til 1968, fortsatt populær, og mange vurderer det "gullstandard" for å identifisere mitokondrielle sykdommer hos pasienter 14,19,26,27. Det er nå ofte brukt for å undersøke mtDNA mutasjon-drevet aldring og aldring-relaterte lidelser 12,13,18,20,21,24. Den COX / SDH dobbel merking metoden er ofte brukt parallelt …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Aging (AG04418), National Institute on Drug Abuse, National Institute of Health-Karolinska Institutet Graduate Partnerships Program, Karolinska Institutet, svensk Forskningsrådet, svensk Brain Power, og svensk Brain Foundation. Mange takk til Mattias Karlen og Dr. Giuseppe Coppotelli for kreative støtte med Figur 1 og 2, henholdsvis; Karin Pernold for teknisk assistanse, og Drs. Barry J. Hoffer, Lars Olson og Nils-Göran Larsson for mye nyttige råd og diskusjon.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Dry Ice | AGA Gas AB | block form | |
| Isopentane (2-methylbutane) | Sigma-Aldrich | 277258 CAS: 78-78-4 |
|
| Cyrostat embedding solution | Sakura Finetek | Tissue Tek 4583 | |
| Cryostat | Microm | Microm Model HM 500M | |
| Slides | Thermo Scientific | Super Frost Plus Menzel Gläser J1800AMWZ |
|
| Cover glasses Borosilicate glass |
VWR International | 16004-098 | 24 x 50 mm |
| Filter Paper | Munktell Filter AB | Quality: 1350 Article Number: 242 001 |
430 x 430 mm |
| 3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | Sigma-Aldrich | Sigma Liquid Substrate System, D7304 | |
| Cytochrome c (Type III, from equine heart) | Sigma-Aldrich | C2506 CAS: 9007-43-6 |
|
| Bovine catalase (from liver) | Sigma-Aldrich | C9322 CAS: 9001-05-2 |
|
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Sigma-Aldrich | N6876 CAS: 298-83-9 |
|
| Sodium succinate | Sigma-Aldrich | S2378 CAS: 6106-21-4 |
|
| Phenazine methosulfate (PMS) | Sigma-Aldrich | P9625 CAS: 299-11-6 |
PMS is light sensitive. Shield from light. |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 CAS: 26628-22-8 |
|
| Xylene | VWR International | EM-XX0060-4 | |
| Entellan | VWR International | 100503-870 | |
| Malonate (Malonic acid) |
Sigma-Aldrich | M1296 CAS: 141-82-2 |
References
- Larsson, N. G. Somatic mitochondrial DNA mutations in mammalian aging. Annu. Rev. Biochem. 79, 683-706 (2010).
- Cottrell, D. A. Role of mitochondrial DNA mutations in disease and aging. Ann. NY Acad. Sci. 908, 199-207 (2000).
- Harman, D. The biologic clock: the mitochondria. J. Am. Geriatr. Soc. 20, 145-147 (1972).
- Wallace, D. C. Mitochondrial genetics – a paradigm for aging and degenerative diseases. Science. 256, 628-632 (1992).
- Trifunovic, A. Premature ageing in mice expressing defective mitochondrial DNA polymerase. Nature. 429, 417-423 (2004).
- Ameur, A. Ultra-deep sequencing of mouse mitochondrial DNA: mutational patterns and their origins. PLoS Genet. 7, e1002028-e1002028 (2011).
- Safdar, A. Endurance exercise rescues progeroid aging and induces systemic mitochondrial rejuvenation in mtDNA mutator mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4135-4140 (2011).
- DiMauro, S., Bonilla, E., Zeviani, M., Nakagawa, M., DeVivo, D. C. Mitochondrial myopathies. Ann. Neurol. 17, 521-538 (1985).
- Old, S. L., Johnson, M. A. Methods of microphotometric assay of succinate dehydrogenase and cytochrome c oxidase activities for use on human skeletal muscle. Histochem. J. 21, 545-555 (1989).
- Chaturvedi, R. K. Impaired PGC-1alpha function in muscle in Huntington’s disease. Hum. Mol. Genet. 18, 3048-3065 (2009).
- Edgar, D. Random point mutations with major effects on protein-coding genes are the driving force behind premature aging in mtDNA mutator mice. Cell. Metab. 10, 131-138 (2009).
- Ross, J. M. High brain lactate is a hallmark of aging and caused by a shift in the lactate dehydrogenase A/B ratio. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 20087-20092 (2010).
- Crugnola, V. Mitochondrial respiratory chain dysfunction in muscle from patients with amyotrophic lateral sclerosis. Arch. Neurol. 67, 849-854 (2010).
- Nonaka, I. Muscle pathology in cytochrome c oxidase deficiency. Acta. Neuropathol. 77, 152-160 (1988).
- DiMauro, S. Mitochondrial encephalomyopathies. Neurol. Clin. 8, 483-506 (1990).
- Bonilla, E. New morphological approaches to the study of mitochondrial encephalomyopathies. Brain. Pathol. 2, 113-119 (1992).
- Brierley, E. J., Johnson, M. A., Lightowlers, R. N., James, O. F., Turnbull, D. M. Role of mitochondrial DNA mutations in human aging: implications for the central nervous system and muscle. Ann. Neurol. 43, 217-223 (1998).
- Borthwick, G. M., Johnson, M. A., Ince, P. G., Shaw, P. J., Turnbull, D. M. Mitochondrial enzyme activity in amyotrophic lateral sclerosis: implications for the role of mitochondria in neuronal cell death. Ann. Neurol. 46, 787-790 (1999).
- Gellerich, F. N. Mitochondrial respiratory rates and activities of respiratory chain complexes correlate linearly with heteroplasmy of deleted mtDNA without threshold and independently of deletion size. Biochim. Biophys. Acta. 1556, 41-52 (2002).
- Larsson, N. G. Mitochondrial transcription factor A is necessary for mtDNA maintenance and embryogenesis in mice. Nat. Genet. 18, 231-236 (1998).
- Ekstrand, M. I. Progressive parkinsonism in mice with respiratory-chain-deficient dopamine neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 1325-1330 (2007).
- Seligman, A. M., Karnovsky, M. J., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. Nondroplet ultrastructural demonstration of cytochrome oxidase activity with a polymerizing osmiophilic reagent, diaminobenzidine (DAB). J. Cell. Biol. 38, 1-14 (1968).
- Dubowitz, V., Brooke, M. Muscle Biopsy: A Modern Approach. , (1973).
- Cottrell, D. A. Cytochrome c oxidase deficient cells accumulate in the hippocampus and choroid plexus with age. Neurobiol. Aging. 22, 265-272 (2001).
- Blanco, C. E., Sieck, G. C., Edgerton, V. R. Quantitative histochemical determination of succinic dehydrogenase activity in skeletal muscle fibres. Histochem. J. 20, 230-243 (1988).
- Moraes, C. T., Ricci, E., Bonilla, E., DiMauro, S., Schon, E. A. The mitochondrial tRNA(Leu(UUR)) mutation in mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes (MELAS): genetic, biochemical, and morphological correlations in skeletal muscle. Am. J. Hum. Genet. 50, 934-949 (1992).
- Petruzzella, V. Extremely high levels of mutant mtDNAs co-localize with cytochrome c oxidase-negative ragged-red fibers in patients harboring a point mutation at nt 3243. Hum. Mol. Genet. 3, 449-454 (1994).
- Tulinius, M. H., Holme, E., Kristiansson, B., Larsson, N. G., Oldfors, A. Mitochondrial encephalomyopathies in childhood. I. Biochemical and morphologic investigations. J. Pediatr. 119, 242-250 (1991).
- Haas, R. H. The in-depth evaluation of suspected mitochondrial disease. Mol. Genet. Metab. 94, 16-37 (2008).
