La visualización de la función respiratoria mitocondrial utilizando citocromo C Oxidasa / Succinato Deshidrogenasa (COX / SDH) de doble etiquetado Histoquímica
Summary
El citocromo c oxidasa / deshidrogenasa de sodio (COX / SDH) de doble etiquetado método permite la visualización directa de las deficiencias de las enzimas respiratorias mitocondriales en secciones de tejido fresco congelado. Esta es una técnica histoquímica directa y es útil en la investigación de las enfermedades mitocondriales, el envejecimiento y los trastornos relacionados con el envejecimiento.
Abstract
El ADN mitocondrial (ADNmt) los defectos son una causa importante de enfermedad y puede ser la base del envejecimiento y el envejecimiento, alteraciones 1,2. La teoría mitocondrial del envejecimiento sugiere un papel de mutaciones en el ADNmt, que pueden alterar la homeostasis de la bioenergética y la función celular, en el proceso de envejecimiento 3. Una gran cantidad de pruebas ha sido elaborado en apoyo de esta teoría de 1,4, siendo un ejemplo el ADN mitocondrial mutador ratón 5, sin embargo, el papel preciso de daño mitocondrial en el envejecimiento no es completamente entendido 6,7.
Observando la actividad de las enzimas respiratorias es un método directo para la investigación de la disfunción mitocondrial. Complejo IV o citocromo c oxidasa (COX), es esencial para la función mitocondrial. Las subunidades catalíticas de la COX son codificadas por el ADNmt y son esenciales para el ensamblaje del complejo (Figura 1). Por lo tanto, la síntesis y funcionamiento se basan principalmente en la integridad del ADNmt 2.Aunque otros complejos respiratorios podrían ser investigados, complejos IV y II son los más susceptibles de examen histoquímico 8,9. Complejo II o succinato deshidrogenasa (SDH), es totalmente codificada por el ADN nuclear (Figura 1), y su actividad no suele ser afectada por un deterioro del ADNmt, a pesar de un aumento puede indicar la biogénesis mitocondrial 10-12. El ADNmt deterioro observado en las enfermedades mitocondriales, el envejecimiento y las enfermedades relacionadas con la edad a menudo conduce a la presencia de células con actividad de la COX bajo o ausente 2,12-14. Aunque las actividades de la COX y SDH pueden ser investigados de forma individual, la secuencial de doble etiquetado método de 15,16 ha demostrado ser ventajoso en la localización de las células con la disfunción mitocondrial 12,17-21.
Muchas de las constituciones óptimo del test, se han determinado, como por ejemplo la concentración de sustrato, receptores de electrones / donantes, intermediarios transportadores de electrones, la influencia del pH, y la reacción time 9,22,23. 3,3 '-diaminobencidina (DAB) es un donador de electrones eficaz y fiable 22. En las células con el funcionamiento de la COX, la indamine marrón polímero producto va a localizar en crestas mitocondriales y saturar las células 22. Aquellas células que tienen disfuncionales COX por lo tanto no estar saturado por el producto DAB, lo que permite la visualización de la actividad SDH por la reducción de nitroazul de tetrazolio (NBT), un receptor de electrones, a un producto final azul formazán 9,24. Citocromo c y sustratos succinato sódico son añadidos para normalizar los niveles endógenos entre el control y los tejidos enfermos / mutante 9. Catalasa se añade como medida de precaución para evitar posibles reacciones contaminantes de la actividad de peroxidasa 9,22. Metosulfato fenazina (PMS), un transportador de electrones intermedia, se utiliza en conjunción con azida sódica, un inhibidor de la cadena respiratoria, para aumentar la formación de los productos de reacción final de 9,25. A pesar de este informeción, algunos detalles importantes que afectan el resultado de este ensayo sencillo decorosa, además de los controles de especificidad y los avances en la técnica, aún no se han presentado.
Protocol
Discussion
La combinación de la COX / SDH método histoquímico permite la visualización de las células con la disfunción mitocondrial. Esta técnica, con los primeros estudios se remontan a 1968, sigue siendo popular, con muchos teniendo en cuenta el "gold standard" para la identificación de las enfermedades mitocondriales en los pacientes 14,19,26,27. Ahora se utiliza con frecuencia para investigar ADNmt mutación impulsada por el envejecimiento y el envejecimiento de los trastornos relacionados con <su…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del Envejecimiento (AG04418), Instituto Nacional sobre Abuso de Drogas, Instituto Nacional de Salud-Karolinska Institutet Programa de Postgrado asociaciones, Karolinska Institutet, Consejo de Investigación sueco, el poder del cerebro de Suecia, y la Fundación Cerebro de Suecia. Muchas gracias a Mattias Karlen y el Dr. Giuseppe Coppotelli de apoyo creativo con la Figura 1 y 2, respectivamente; Karin Pernold de asistencia técnica, y los Dres. Barry J. Hoffer, Lars Olson, y Nils-Göran Larsson para muchos consejos útiles y la discusión.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Dry Ice | AGA Gas AB | block form | |
| Isopentane (2-methylbutane) | Sigma-Aldrich | 277258 CAS: 78-78-4 |
|
| Cyrostat embedding solution | Sakura Finetek | Tissue Tek 4583 | |
| Cryostat | Microm | Microm Model HM 500M | |
| Slides | Thermo Scientific | Super Frost Plus Menzel Gläser J1800AMWZ |
|
| Cover glasses Borosilicate glass |
VWR International | 16004-098 | 24 x 50 mm |
| Filter Paper | Munktell Filter AB | Quality: 1350 Article Number: 242 001 |
430 x 430 mm |
| 3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | Sigma-Aldrich | Sigma Liquid Substrate System, D7304 | |
| Cytochrome c (Type III, from equine heart) | Sigma-Aldrich | C2506 CAS: 9007-43-6 |
|
| Bovine catalase (from liver) | Sigma-Aldrich | C9322 CAS: 9001-05-2 |
|
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Sigma-Aldrich | N6876 CAS: 298-83-9 |
|
| Sodium succinate | Sigma-Aldrich | S2378 CAS: 6106-21-4 |
|
| Phenazine methosulfate (PMS) | Sigma-Aldrich | P9625 CAS: 299-11-6 |
PMS is light sensitive. Shield from light. |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 CAS: 26628-22-8 |
|
| Xylene | VWR International | EM-XX0060-4 | |
| Entellan | VWR International | 100503-870 | |
| Malonate (Malonic acid) |
Sigma-Aldrich | M1296 CAS: 141-82-2 |
References
- Larsson, N. G. Somatic mitochondrial DNA mutations in mammalian aging. Annu. Rev. Biochem. 79, 683-706 (2010).
- Cottrell, D. A. Role of mitochondrial DNA mutations in disease and aging. Ann. NY Acad. Sci. 908, 199-207 (2000).
- Harman, D. The biologic clock: the mitochondria. J. Am. Geriatr. Soc. 20, 145-147 (1972).
- Wallace, D. C. Mitochondrial genetics – a paradigm for aging and degenerative diseases. Science. 256, 628-632 (1992).
- Trifunovic, A. Premature ageing in mice expressing defective mitochondrial DNA polymerase. Nature. 429, 417-423 (2004).
- Ameur, A. Ultra-deep sequencing of mouse mitochondrial DNA: mutational patterns and their origins. PLoS Genet. 7, e1002028-e1002028 (2011).
- Safdar, A. Endurance exercise rescues progeroid aging and induces systemic mitochondrial rejuvenation in mtDNA mutator mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4135-4140 (2011).
- DiMauro, S., Bonilla, E., Zeviani, M., Nakagawa, M., DeVivo, D. C. Mitochondrial myopathies. Ann. Neurol. 17, 521-538 (1985).
- Old, S. L., Johnson, M. A. Methods of microphotometric assay of succinate dehydrogenase and cytochrome c oxidase activities for use on human skeletal muscle. Histochem. J. 21, 545-555 (1989).
- Chaturvedi, R. K. Impaired PGC-1alpha function in muscle in Huntington’s disease. Hum. Mol. Genet. 18, 3048-3065 (2009).
- Edgar, D. Random point mutations with major effects on protein-coding genes are the driving force behind premature aging in mtDNA mutator mice. Cell. Metab. 10, 131-138 (2009).
- Ross, J. M. High brain lactate is a hallmark of aging and caused by a shift in the lactate dehydrogenase A/B ratio. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 20087-20092 (2010).
- Crugnola, V. Mitochondrial respiratory chain dysfunction in muscle from patients with amyotrophic lateral sclerosis. Arch. Neurol. 67, 849-854 (2010).
- Nonaka, I. Muscle pathology in cytochrome c oxidase deficiency. Acta. Neuropathol. 77, 152-160 (1988).
- DiMauro, S. Mitochondrial encephalomyopathies. Neurol. Clin. 8, 483-506 (1990).
- Bonilla, E. New morphological approaches to the study of mitochondrial encephalomyopathies. Brain. Pathol. 2, 113-119 (1992).
- Brierley, E. J., Johnson, M. A., Lightowlers, R. N., James, O. F., Turnbull, D. M. Role of mitochondrial DNA mutations in human aging: implications for the central nervous system and muscle. Ann. Neurol. 43, 217-223 (1998).
- Borthwick, G. M., Johnson, M. A., Ince, P. G., Shaw, P. J., Turnbull, D. M. Mitochondrial enzyme activity in amyotrophic lateral sclerosis: implications for the role of mitochondria in neuronal cell death. Ann. Neurol. 46, 787-790 (1999).
- Gellerich, F. N. Mitochondrial respiratory rates and activities of respiratory chain complexes correlate linearly with heteroplasmy of deleted mtDNA without threshold and independently of deletion size. Biochim. Biophys. Acta. 1556, 41-52 (2002).
- Larsson, N. G. Mitochondrial transcription factor A is necessary for mtDNA maintenance and embryogenesis in mice. Nat. Genet. 18, 231-236 (1998).
- Ekstrand, M. I. Progressive parkinsonism in mice with respiratory-chain-deficient dopamine neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 1325-1330 (2007).
- Seligman, A. M., Karnovsky, M. J., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. Nondroplet ultrastructural demonstration of cytochrome oxidase activity with a polymerizing osmiophilic reagent, diaminobenzidine (DAB). J. Cell. Biol. 38, 1-14 (1968).
- Dubowitz, V., Brooke, M. Muscle Biopsy: A Modern Approach. , (1973).
- Cottrell, D. A. Cytochrome c oxidase deficient cells accumulate in the hippocampus and choroid plexus with age. Neurobiol. Aging. 22, 265-272 (2001).
- Blanco, C. E., Sieck, G. C., Edgerton, V. R. Quantitative histochemical determination of succinic dehydrogenase activity in skeletal muscle fibres. Histochem. J. 20, 230-243 (1988).
- Moraes, C. T., Ricci, E., Bonilla, E., DiMauro, S., Schon, E. A. The mitochondrial tRNA(Leu(UUR)) mutation in mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes (MELAS): genetic, biochemical, and morphological correlations in skeletal muscle. Am. J. Hum. Genet. 50, 934-949 (1992).
- Petruzzella, V. Extremely high levels of mutant mtDNAs co-localize with cytochrome c oxidase-negative ragged-red fibers in patients harboring a point mutation at nt 3243. Hum. Mol. Genet. 3, 449-454 (1994).
- Tulinius, M. H., Holme, E., Kristiansson, B., Larsson, N. G., Oldfors, A. Mitochondrial encephalomyopathies in childhood. I. Biochemical and morphologic investigations. J. Pediatr. 119, 242-250 (1991).
- Haas, R. H. The in-depth evaluation of suspected mitochondrial disease. Mol. Genet. Metab. 94, 16-37 (2008).
