Sitokrom kullanarak Mitokondriyal Solunum Fonksiyon Görselleştirme C Oksidaz / Succinat Dehidrogenaz (COX / SDH) Çift-etiketleme Histokimya
Summary
Sitokrom c oksidaz / sodyum dehidrogenaz (COX / SDH) çift etiketleme yöntemi, doğrudan bir görünüm için taze dondurulmuş doku kesitlerinde mitokondriyal solunum enzim eksiklikleri sağlar. Bu basit bir histokimyasal teknik ve mitokondriyal hastalıklar, yaşlanma, yaşlanma ile ilişkili bozukluklar araştıran yararlıdır.
Abstract
Mitokondriyal DNA (mtDNA) kusurlar, önemli bir hastalık nedenidir ve değişiklikler 1,2 yaşlanmaya ve yaşlanma ile ilgili temelini olabilir . Mitokondriyal teorisi yaşlanma, yaşlanma süreci 3, biyoenerjetik homeostazı ve hücresel fonksiyon değiştirebilir mtDNA mutasyonlarının için bir rol göstermektedir . Kanıtların bir servet bu teori 1,4, 5 mtDNA Mutator fare bir örnek destek derlenmiştir, ancak, yaşlanma mtDNA hasarı kesin rolü 6,7 tamamen anlaşılmış değildir.
Solunum enzimleri aktivite Gözlem mitokondriyal disfonksiyonu araştırmak için basit bir yaklaşımdır. Kompleks IV veya sitokrom c oksidaz (COX), mitokondriyal fonksiyon için çok önemlidir. COX katalitik alt birimden mtDNA tarafından kodlanan ve karmaşık montaj (Şekil 1) için gereklidir. Böylece, doğru sentezi ve işlevi büyük ölçüde mtDNA bütünlüğünü 2 dayanmaktadır .Konusu olsa da, diğer solunum yolu kompleksleri incelenmiştir Kompleksleri IV ve II histokimyasal inceleme 8,9 için en müsait. Kompleks II veya süksinat dehidrogenaz (SDH), mitokondriyal biyogenezi 10-12 bir artış gösteriyor olabilir rağmen, tamamen nükleer DNA (Şekil 1) tarafından kodlanır ve faaliyet genellikle etkilenen engelli mtDNA değildir. Engelli mtDNA yaşlanma, mitokondriyal hastalıklarda gözlenen ve yaşla ilişkili hastalıklar genellikle, düşük ya da hiç COX aktivitesi 2,12-14 hücrelerin varlığı yol açar . COX ve SDH faaliyetleri ayrı ayrı incelenmiştir olmasına rağmen, 15,16 ardışık çift etiketleme yöntemi, 12,17-21 mitokondriyal disfonksiyon hücrelerin yerini avantajlı olduğu kanıtlanmıştır.
Testin en uygun anayasaların çoğu substrat konsantrasyonu, elektron alıcısı / donörler, ara elektron taşıyıcıları, pH etkisi, ve reaksiyon t gibi tespit edilmiştirime 9,22,23. 3,3 '-diaminobenzidin (DAB), etkili ve güvenilir bir elektron donörü 22 . , Kahverengi indamine polimer ürünü işleyen COX hücrelerinde mitokondriyal cristae yerelleştirme ve hücreler 22 doyurabilecek. Bu nedenle, işlevsiz COX ile bu hücrelerin mavi formazan son ürün 9,24 nitroblue tetrazolium (NBT), bir elektron alıcısı azaltılması SDH aktivite görselleştirme için izin DAB ürün doymuş olmaz. Sitokrom c ve sodyum süksinat substratlar kontrolü ve mutant / hastalıklı dokuların 9 arasında endojen düzeylerini normalleştirmek için eklenir. Katalaz peroksidaz aktivitesini 9,22 mümkün kirlenmesine neden olan reaksiyonları önlemek için bir önlem olarak eklenir. Phenazine methosulfate (PMS), bir ara elektron taşıyıcı, son reaksiyon ürünlerinin 9,25 oluşumunu arttırmak için sodyum azid, bir solunum zinciri inhibitörü ile birlikte kullanılır. Bu bilgilendirmek rağmenation, bu yakışık alır basit bir testin sonucu etkileyen bazı kritik detayları, özgüllük kontrolleri ve tekniği gelişmeler yanı sıra, henüz sunulmuş değil.
Protocol
Discussion
Kombine COX / SDH histokimyasal yöntemi mitokondriyal disfonksiyonu olan hücrelerin görselleştirme sağlar. Bu teknik, erken çalışmalar 1968 yılına kadar uzanan, birçok hasta 14,19,26,27 mitokondriyal hastalıkların belirlenmesi için "altın standart" dikkate alınarak, popüler olmaya devam etmektedir. Şimdi, mtDNA mutasyonu odaklı yaşlanmaya ve yaşlanma ile ilişkili bozukluklar 12,13,18,20,21,24 araştırmak için sık sık kullanılır. COX / SDH çift etiketleme yönt…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Yaşlanma Enstitüsü (AG04418), İlaç Suistimali Ulusal Enstitüsü, Sağlık-Karolinska Enstitüsünde Lisansüstü Ortaklıkları Programı Ulusal Enstitüsü, Karolinska Enstitüsünde, İsveç Araştırma Konseyi, İsveç Beyin Gücü ve İsveç Beyin Vakfı tarafından desteklenmiştir. Birçok yaratıcı destek için sırasıyla Şekil 1 ve 2, Mattias Karlen ve Dr. Giuseppe Coppotelli sayesinde, teknik yardım için Pernold Karin ve Dr. Barry J. Hoffer, çok yararlı öneriler ve tartışma Lars Olson ve Nils-Göran Larsson.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Dry Ice | AGA Gas AB | block form | |
| Isopentane (2-methylbutane) | Sigma-Aldrich | 277258 CAS: 78-78-4 |
|
| Cyrostat embedding solution | Sakura Finetek | Tissue Tek 4583 | |
| Cryostat | Microm | Microm Model HM 500M | |
| Slides | Thermo Scientific | Super Frost Plus Menzel Gläser J1800AMWZ |
|
| Cover glasses Borosilicate glass |
VWR International | 16004-098 | 24 x 50 mm |
| Filter Paper | Munktell Filter AB | Quality: 1350 Article Number: 242 001 |
430 x 430 mm |
| 3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | Sigma-Aldrich | Sigma Liquid Substrate System, D7304 | |
| Cytochrome c (Type III, from equine heart) | Sigma-Aldrich | C2506 CAS: 9007-43-6 |
|
| Bovine catalase (from liver) | Sigma-Aldrich | C9322 CAS: 9001-05-2 |
|
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Sigma-Aldrich | N6876 CAS: 298-83-9 |
|
| Sodium succinate | Sigma-Aldrich | S2378 CAS: 6106-21-4 |
|
| Phenazine methosulfate (PMS) | Sigma-Aldrich | P9625 CAS: 299-11-6 |
PMS is light sensitive. Shield from light. |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 CAS: 26628-22-8 |
|
| Xylene | VWR International | EM-XX0060-4 | |
| Entellan | VWR International | 100503-870 | |
| Malonate (Malonic acid) |
Sigma-Aldrich | M1296 CAS: 141-82-2 |
References
- Larsson, N. G. Somatic mitochondrial DNA mutations in mammalian aging. Annu. Rev. Biochem. 79, 683-706 (2010).
- Cottrell, D. A. Role of mitochondrial DNA mutations in disease and aging. Ann. NY Acad. Sci. 908, 199-207 (2000).
- Harman, D. The biologic clock: the mitochondria. J. Am. Geriatr. Soc. 20, 145-147 (1972).
- Wallace, D. C. Mitochondrial genetics – a paradigm for aging and degenerative diseases. Science. 256, 628-632 (1992).
- Trifunovic, A. Premature ageing in mice expressing defective mitochondrial DNA polymerase. Nature. 429, 417-423 (2004).
- Ameur, A. Ultra-deep sequencing of mouse mitochondrial DNA: mutational patterns and their origins. PLoS Genet. 7, e1002028-e1002028 (2011).
- Safdar, A. Endurance exercise rescues progeroid aging and induces systemic mitochondrial rejuvenation in mtDNA mutator mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4135-4140 (2011).
- DiMauro, S., Bonilla, E., Zeviani, M., Nakagawa, M., DeVivo, D. C. Mitochondrial myopathies. Ann. Neurol. 17, 521-538 (1985).
- Old, S. L., Johnson, M. A. Methods of microphotometric assay of succinate dehydrogenase and cytochrome c oxidase activities for use on human skeletal muscle. Histochem. J. 21, 545-555 (1989).
- Chaturvedi, R. K. Impaired PGC-1alpha function in muscle in Huntington’s disease. Hum. Mol. Genet. 18, 3048-3065 (2009).
- Edgar, D. Random point mutations with major effects on protein-coding genes are the driving force behind premature aging in mtDNA mutator mice. Cell. Metab. 10, 131-138 (2009).
- Ross, J. M. High brain lactate is a hallmark of aging and caused by a shift in the lactate dehydrogenase A/B ratio. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 20087-20092 (2010).
- Crugnola, V. Mitochondrial respiratory chain dysfunction in muscle from patients with amyotrophic lateral sclerosis. Arch. Neurol. 67, 849-854 (2010).
- Nonaka, I. Muscle pathology in cytochrome c oxidase deficiency. Acta. Neuropathol. 77, 152-160 (1988).
- DiMauro, S. Mitochondrial encephalomyopathies. Neurol. Clin. 8, 483-506 (1990).
- Bonilla, E. New morphological approaches to the study of mitochondrial encephalomyopathies. Brain. Pathol. 2, 113-119 (1992).
- Brierley, E. J., Johnson, M. A., Lightowlers, R. N., James, O. F., Turnbull, D. M. Role of mitochondrial DNA mutations in human aging: implications for the central nervous system and muscle. Ann. Neurol. 43, 217-223 (1998).
- Borthwick, G. M., Johnson, M. A., Ince, P. G., Shaw, P. J., Turnbull, D. M. Mitochondrial enzyme activity in amyotrophic lateral sclerosis: implications for the role of mitochondria in neuronal cell death. Ann. Neurol. 46, 787-790 (1999).
- Gellerich, F. N. Mitochondrial respiratory rates and activities of respiratory chain complexes correlate linearly with heteroplasmy of deleted mtDNA without threshold and independently of deletion size. Biochim. Biophys. Acta. 1556, 41-52 (2002).
- Larsson, N. G. Mitochondrial transcription factor A is necessary for mtDNA maintenance and embryogenesis in mice. Nat. Genet. 18, 231-236 (1998).
- Ekstrand, M. I. Progressive parkinsonism in mice with respiratory-chain-deficient dopamine neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 1325-1330 (2007).
- Seligman, A. M., Karnovsky, M. J., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. Nondroplet ultrastructural demonstration of cytochrome oxidase activity with a polymerizing osmiophilic reagent, diaminobenzidine (DAB). J. Cell. Biol. 38, 1-14 (1968).
- Dubowitz, V., Brooke, M. Muscle Biopsy: A Modern Approach. , (1973).
- Cottrell, D. A. Cytochrome c oxidase deficient cells accumulate in the hippocampus and choroid plexus with age. Neurobiol. Aging. 22, 265-272 (2001).
- Blanco, C. E., Sieck, G. C., Edgerton, V. R. Quantitative histochemical determination of succinic dehydrogenase activity in skeletal muscle fibres. Histochem. J. 20, 230-243 (1988).
- Moraes, C. T., Ricci, E., Bonilla, E., DiMauro, S., Schon, E. A. The mitochondrial tRNA(Leu(UUR)) mutation in mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes (MELAS): genetic, biochemical, and morphological correlations in skeletal muscle. Am. J. Hum. Genet. 50, 934-949 (1992).
- Petruzzella, V. Extremely high levels of mutant mtDNAs co-localize with cytochrome c oxidase-negative ragged-red fibers in patients harboring a point mutation at nt 3243. Hum. Mol. Genet. 3, 449-454 (1994).
- Tulinius, M. H., Holme, E., Kristiansson, B., Larsson, N. G., Oldfors, A. Mitochondrial encephalomyopathies in childhood. I. Biochemical and morphologic investigations. J. Pediatr. 119, 242-250 (1991).
- Haas, R. H. The in-depth evaluation of suspected mitochondrial disease. Mol. Genet. Metab. 94, 16-37 (2008).
