संवर्धन और NRCC पैच दबाना चिप्स पर कक्ष के इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी

Summary

हम बताते हैं कैसे planar पैच – दबाना चिप्स कनाडा के राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद निष्फल कर रहे हैं, से primed, मध्यम के साथ भरी हुई है, कोशिकाओं के साथ चढ़ाया, गढ़े और electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया.

Abstract

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard of electrophysiology applied to disease models and pharmaceutical screens alike ¹. The method traditionally involves gently contacting a cell with a glass pipette filled by a physiological solution in order to isolate a patch of the membrane under its apex ². An electrode inserted in the pipette captures ion-channel activity within the membrane patch or, when ruptured, for the whole cell. In the last decade, patch-clamp chips have been proposed as an alternative ^{3, 4}: a suspended film separates the physiological medium from the culture medium, and an aperture microfabricated in the film replaces the apex of the pipette. Patch-clamp chips have been integrated in automated systems and commercialized for high-throughput screening ⁵. To increase throughput, they include the fluidic delivery of cells from suspension, their positioning on the aperture by suction, and automated routines to detect cell-to-probe seals and enter into whole cell mode. We have reported on the fabrication of a silicon patch-clamp chip with optimized impedance and orifice shape that permits the high-quality recording of action potentials in cultured snail neurons ⁶; recently, we have also reported progress towards interrogating mammalian neurons ⁷. Our patch-clamp chips are fabricated at the Canadian Photonics Fabrication Centre ⁸, a commercial foundry, and are available in large series. We are eager to engage in collaborations with electrophysiologists to validate the use of the NRCC technology in different models. The chips are used according to the general scheme represented in Figure 1: the silicon chip is at the bottom of a Plexiglas culture vial and the back of the aperture is connected to a subterranean channel fitted with tubes at either end of the package. Cells are cultured in the vial and the cell on top of the probe is monitored by a measuring electrode inserted in the channel.The two outside fluidic ports facilitate solution exchange with minimal disturbance to the cell; this is an advantage compared to glass pipettes for intracellular perfusion.

Figure 1. Principle of measurement using the NRCC patch-clamp chip

We detail here the protocols to sterilize and prime the chips, load them with medium, plate them with cells, and finally use them for electrophysiological recordings.

Protocol

1. चिप निर्माण 6 परिणामों में एक 3 माइक्रोन मोटी फिल्म स्वयं खड़े एक कम 1 Mohm उपयोग प्रतिरोध और एक चिकनी सतह कीप के आकार एपर्चर है कि 9 सेल के साथ एक अंतरंग सील की सुविधा में वर्णित प्रक्रिया, चित्र 2 देखें. चिप्स और singulated एपर्चर के साथ एक छेद एक भूमिगत चैनल चिप को जोड़ने का सामना करना पड़ Plexiglas संकुल में सरेस से जोड़ा हुआ. gluing एक तरीका है कि एक नाममात्र 17 पीएफ के लिए अलग धकेलना समाई कम से कम में तिरस्कृत किया. पैकेज दो 1.5 मिमी व्यास और 6 मिमी fluidic बंदरगाहों के रूप में लंबे ग्लास ट्यूब (चित्रा 3) के साथ लगे हैं. चित्रा 2 NRCC चिप पैच – दबाना के एक केंद्रित आयन बीम अनुभाग की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ. एक चिकनी सिलिकॉन डाइऑक्साइड सतह और कीप के आकार कि अंतरंग सेल संपर्क के पक्ष है, और एक कम उपयोग resistanc के लिए एक उथले छिद्र है कि खातों से पता चलता हैई. चित्रा 3. एक चिप संस्कृति शीशी के नीचे एक Plexiglas भूमिगत fluidics और ग्लास ट्यूब के साथ फिट पैकेज में सरेस से जोड़ा हुआ है. 2. नसबंदी भड़काना, और परीक्षण निम्नलिखित चरणों का एक जीव विज्ञान सुरक्षा कैबिनेट में प्रदर्शन किया जाना चाहिए संदूषण या एपर्चर की plugging के से बचने के लिए. एक Harrick बुनियादी प्लाज्मा क्लीनर (www.harrickplasma.com) में 18 व अन्य हवा प्लाज्मा सिस्टम की अधिकतम शक्ति पर 15 मिनट के लिए एक 0.1-0.3 एम्बार अवशिष्ट हवा के दबाव के साथ चिप्स जीवाणुरहित तुलनीय शक्ति घनत्व (24 मेगावाट के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है / 3 सेमी) और शक्ति घनत्व और समय के उत्पाद स्थिर रखने के. प्लाज्मा उपचार भी चिप्स हाइड्रोफिलिक renders, जो भड़काना सुविधा. में बाँझ Silastic प्रयोगशाला सिलिकॉन टयूबिंग, 1mm आईडी x 2mm आयुध डिपो (कोल परमार के साथ ग्लास ट्यूब फ़िटबिल्ली. #) 96,115-08, एक तरफ 3inch, दूसरी तरफ 1 इंच. बाँझ फ़िल्टर मानक फास्फेट बफर समाधान (पीबीएस) के साथ ट्यूबों के माध्यम से fluidics भरें, कोई बुलबुला फंस गया है सुनिश्चित करने. जबकि एक एटीएम पर कम ओर से पीबीएस दबाव लंबी सिलिकॉन ट्यूब क्लिप. पीबीएस की एक पूल एपर्चर के माध्यम से रिसाव शीशी में दिखाई हो सकता है. पीबीएस के दबाव की आपूर्ति क्लिप और है कि आपूर्ति से कम सिलिकॉन ट्यूब अलग. शीशी फ़िल्टर पीबीएस एक सिरिंज का उपयोग कर के साथ भरें. छोटी ट्यूब में सीएल इलेक्ट्रोड और एक शीशी में इलेक्ट्रोड: एजी / एजी विसर्जित कर दिया. एक प्रतिबाधा मीटर पुष्टि करते हैं कि उपयोग प्रतिरोध है प्रयोग किया जाता है 300kohm और 3Mohm और अलग धकेलना समाई 10pF और 25pF के बीच के बीच है. एक कम प्रतिरोध के साथ एक चिप के लिए एक रिसाव की संभावना है, और एक उच्च समाई उपयोग के लिए अनुचित माना जाता है के रूप में यह सेल 6 इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी की सबसे तेजी से गतिशीलता पर कब्जा नहीं कर सकता. एक कम समाई के साथ एक चिपया उच्च प्रतिरोध खामियों को दूर माना जाता है, हालांकि यह बस हो सकता है कि एक बुलबुला छिद्र में फंस सकता है. कुछ चिप्स 1h के बाद पुन: परीक्षण और सही विद्युत प्रतिबाधा पाया. बाँझ विआयनीकृत पानी के साथ fluidic चैनल फ्लश, शीर्ष शीशी खाली और एक ही दो बार कुल्ला. अन्य चिप्स के साथ एक बाँझ बाँझ विआयनीकृत पानी से भरा कंटेनर में लोड है 30min के लिए ताजा बाँझ विआयनीकृत पानी में ट्यूबों के साथ पैक चिप तो विसर्जित कर दिया है. यह सुनिश्चित करता है कि चिप्स हाइड्रोफिलिक और संदूषण से सुरक्षित रहते हैं. 3. कोशिका जीव विज्ञान प्रयोगशाला में चिप्स तैयारी निम्नलिखित कदम एक HEPA फ़िल्टर लामिना का प्रवाह सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग कर हुड में प्रदर्शन कर रहे हैं, सभी इस प्रक्रिया में इस्तेमाल किया समाधान फ़िल्टर से पहले निष्फल करने के लिए एक 0.22μm फिल्टर का उपयोग कर का उपयोग करना चाहिए. एक HEPA फ़िल्टर लामिना का प्रवाह हुड के तहत एक चिप कंटेनर खोलें और conta से चिप्स को हटा देंiner नीचे का सामना करने के लिए शीर्ष शीशी में संभव अस्थायी contaminants के scooping से बचने. हौसले फ़िल्टर बाँझ विआयनीकृत पानी के साथ चिप 2x की शीशी के ऊपर कुल्ला सतह चिप से किसी भी अवशिष्ट मलबे को हटाने के लिए. शीर्ष शीशी बंद बाँझ विआयनीकृत पानी महाप्राण (व्यंजन). Silastic टयूबिंग दबाव युक्त सिरिंज बाँझ फ़िल्टर विआयनीकृत पानी fluidic चैनल के लिए संलग्न के एक छोर से कनेक्ट. हमारी प्रणाली में, एक संपीड़ित हवा टैंक 20psi के लिए सेट करने के लिए कनेक्शन के द्वारा समाधान के साथ भरा सीरिंज दबाव हैं. बाँझपन को सुनिश्चित करने के लिए, हवा (0.22 माइक्रोन फिल्टर) फ़िल्टर्ड है सिरिंज में प्रवेश करने से पहले और भी हमारे सिस्टम पर / बंद वाल्व है कि हमें रोकने के लिए या दबाव लागू होते हैं जब जरूरत की अनुमति देता है. एक hemostat का प्रयोग, टयूबिंग के उत्पादन अंत दबाना. पर / बंद वाल्व खोलने के लिए समाधान पर दबाव डालने के लिए. ताजा बाँझ विआयनीकृत पानी के साथ चिप के subterranen fluidic कुल्ला करने के लिए, टयूबिंग की उत्पादन अंत unclamp करें. करने के लिएCE के एपर्चर के माध्यम से पानी, एक hemostat के साथ टयूबिंग के उत्पादन अंत दबाना. पानी की निकासी से बचने के लिए, एक hemostats साथ टयूबिंग के इनपुट और आउटपुट के सिरों को दबाना और पर / बंद वाल्व बंद. सिरिंज से टयूबिंग की इनपुट अंत अलग करें. टयूबिंग के दोनों सिरों में कांच प्लग डालें और hemostats को हटा दें. फिल्टर steriled विआयनीकृत पानी के साथ शीर्ष शीशी भरें. एक 100 मिमी बाँझ पकवान के आधार में एक 35 मिमी बाँझ पकवान का ढक्कन रखें ढक्कन 35 मिमी और 100 मिमी पकवान ढक्कन के साथ कवर के शीर्ष पर जगह चिप. छवि चिप्स कि झिल्ली और चिप्स के एपर्चर मलबे और / या हवा के बुलबुले के लिए स्वतंत्र हैं सुनिश्चित करने के लिए हमारी प्रयोगशाला में हम एक ईमानदार खुर्दबीन और एक 20x लंबे समय तक काम दूरी उद्देश्य का उपयोग करें. यदि मलबे और / या हवा बुलबुले मौजूद हैं, बार बार fluidic चैनल और शीर्ष शीशी फ्लश. यदि मलबे और / या हवाई बुलबुले नहीं हटाया जा सकता है चिप खारिज कर दिया है. एक बार चिप्सछवि, लामिना का प्रवाह हुड पर लौटने और टयूबिंग के दोनों सिरों को हाल चलाना. टयूबिंग की एक छोर से दबाव युक्त सिरिंज शारीरिक मीडिया के लिए देते हैं. टयूबिंग के एक hemostat साथ में उत्पादन अंत क्लैंप दबाव वाल्व खोलें, fluidics का उत्पादन अंत से हटाने के hemostat और शारीरिक मीडिया के साथ fluidic चैनल फ्लश शारीरिक मीडिया के साथ भूमिगत fluidic कुल्ला, पर / बंद वाल्व खोलने और टयूबिंग के उत्पादन के अंत से hemostat हटा. शारीरिक मीडिया एपर्चर के माध्यम से बल, एक hemostat के साथ टयूबिंग के उत्पादन अंत दबाना. एक hemostat साथ में टयूबिंग के इनपुट के अंत दबाना और पर / बंद वाल्व बंद. सिरिंज और प्लग glas प्लग के साथ टयूबिंग के दोनों सिरों से टयूबिंग इनपुट अंत निकालें. Hemostats निकालें. शीर्ष शीशी से पानी निकालें. फिल्टर निष्फल शारीरिक मीडिया के साथ शीर्ष शीशी भरें. चिप वापस 100 मिमी पेट्री डिश में रखें. 100 मिमी पकवान में एक 35 मिमी पकवान के आधार प्लेस और यह फिल्टर निष्फल विआयनीकृत पानी के साथ भरने के लिए नमी को समृद्ध. पकवान कवर जब तक यह चढ़ाना के लिए समय है 4. घोंघा न्यूरॉन्स की सेल चढ़ाना पैच दबाना चिप्स की तैयारी की एक किस्म के लिए उपयुक्त हो सकता है. हम स्तनधारी प्राथमिक cortical न्यूरॉन्स के साथ वर्तमान में हमारे चिप्स परीक्षण और 14 7 दिन, जो इंगित करता है कि हमारे नसबंदी प्रोटोकॉल पर्याप्त है और कि चिप्स दीर्घकालिक संस्कृतियों में में साइटोटोक्सिक नहीं हैं के लिए संवर्धित कोशिकाओं के साथ प्रारंभिक परिणाम प्राप्त. इस प्रोटोकॉल के प्रयोजन के लिए, घोंघा न्यूरॉन्स चुना गया था क्योंकि वे एक सरल लेकिन अच्छी तरह से स्थापित अध्ययन के लिए neuronal इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी 11 मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं, और यह उन कोशिकाओं के साथ है कि हम 10 तारीख करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण परिणाम प्राप्त किया है. विस्तृत सेल अलगाव और संस्कृति की प्रक्रिया हैपहले 12, 13 में वर्णित है. – कुंद संदंश और 10% लिस्ट्रीन युक्त Lymnaea खारा में चतनाशून्य करना जानवरों के साथ 2-3 महीने पुरानी Lymnaea stagnalis से बाहरी कवच निकालें. बाद के सभी चरणों का एक लामिना airflow के हुड के भीतर aseptically निष्फल विच्छेदन और कमरे के तापमान पर उपकरण समाधान के साथ प्रदर्शन किया. Fluidics में शारीरिक मीडिया उचित रिकॉर्डिंग एक Eppendorf विंदुक का उपयोग समाधान के साथ बदलें. Lymnaea न्यूरॉन्स के मामले में समाधान (मिमी): 50 KCl, 5 2 MgCl, 5 ethylenebis (oxyethylenenitrilo) tetraacetic एसिड (EGTA) और 4 5 (2 hydroxyethyl) 1 piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES, पीएच 7.4 14 130 mOsm के); एक Sylgard Lymnaea खारा से भरा पकवान में घोंघे पिन और पूरे मस्तिष्क को हटाने के रूप में पहले 13 में वर्णित ISOLAT समझोएड दिमाग में परिभाषित मीडिया (डीएम) trypsin एंजाइम के साथ डीएम और trypsin अवरोध करनेवाला में 15 मिनट के लिए उपचार (सिग्मा, सोयाबीन, कैटलॉग टी 9003) के बाद 18 मिनट के लिए (0.2% समाधान, सिग्मा, कैटलॉग टी 9201). (1M ग्लूकोज 20 एमएल डीएम समाधान के 750 μL ग्लूकोज जोड़ी के साथ डीएम HODM) एक छोटे से Sylgard उच्च मीडिया परिभाषित osmolarity साथ भरा पकवान में दिमाग पिन. ठीक संदंश और विच्छेदन कैंची का प्रयोग, ब्याज की ganglia के बाहरी और आंतरिक म्यान निकालने के लिए, न्यूरॉन्स को उजागर. आग पॉलिश कांच HODM से भरा और एक microsyringe से जुड़ी विंदुक का प्रयोग, कोमल चूषण लागू ब्याज की सेल (वाम पेडल एक पृष्ठीय) के पास जब तक न्यूरॉन मस्तिष्क से detaches और के विंदुक में निलंबित कर दिया है. कांच विंदुक तो और ले जाया जाता है व्यक्ति neurochips जहां microsyringe से कोमल निष्कासन न्यूरॉन्स धीरे विंदुक के बाहर धक्का दे दिया और चिप्स पर व्यक्तिगत पैच छेद के शीर्ष पर रखा जाता है की अनुमति देता है में डूबा हुआ है. कोशिकाओं 2 की एक न्यूनतम के लिए undisturbed बैठने के लिए कमरे के तापमान पर चिप एपर्चर आसपास के सतह के लिए उनके लगाव को बढ़ावा देने की अनुमति दें. 5. Electrophysiological रिकॉर्डिंग प्रवर्धक चिप्स कनेक्ट (हमारे मामले में एक Multiclamp 700B एम्पलीफायर, आण्विक उपकरण, फोस्टर शहर, सीए, संयुक्त राज्य अमेरिका) भूमिगत fluidic है और उचित रिकॉर्डिंग समाधान के साथ चिप शीशी में समाधान बदलें. Lymnaea न्यूरॉन्स के मामले में, ऊपरी संस्कृति कक्षों Lymnaea खारा के साथ भर रहे हैं (मिमी में: NaCl 51.3, 1.7 KCl, 4, CaCl2 और MgCl2 1.5 के) HEPES साथ 7.9 पीएच के लिए बफर 14. स्थिरता के लिए, गोंद एक गिलास स्लाइड पर चिप और एक खुर्दबीन के नीचे जगह है. प्रवर्धक (हमारे मामले में एक Multiclamp 700B एम्पलीफायर, आण्विक उपकरण, फोस्टर शहर, सीए, संयुक्त राज्य अमेरिका) के लिए चिप कनेक्ट, टयूबिंग की एक अंत में कटौती और silve सम्मिलित हैआर जो तार सिर मंच से जुड़ा है. चिप के शीर्ष शीशी में संदर्भ इलेक्ट्रोड रखें. चिप अब है रिकॉर्डिंग के लिए तैयार है. (पूरे सेल आर टी = 50-100 MΩ प्लस capacitive यात्रियों संकेत सेल संलग्न (आर टी> 1 GΩ): एक 5 प्रवर्धक साथ एम वी कदम कुल प्रतिरोध को मापने के (आर टी) और न्यूरॉन्स के विन्यास निर्धारित लागू करें या नहीं मुहर (आर <टी 5 MΩ से), एपर्चर अधिक झिल्ली टूटना). हमारे 10 प्रयोगों के अंतिम सेट में, कोशिकाओं के 58% प्रतिशत उच्च प्रतिरोध जवानों था और उन की कोशिकाओं के 80% उत्तेजनीय प्रतिक्रिया से पता चला. 6. प्रतिनिधि परिणाम न्यूरॉन (इस LPeD1 मामले में) के लिए वर्तमान दालों (20 पीए वेतन वृद्धि) depolarizing लागू करें. VM उसके आराम की क्षमता के लिए करीब (60 एम वी ~) में न्यूरॉन पकड़ो. इन depolarizing दालों के लिए प्रतिक्रियाओं का निरीक्षण. Overshooting कार्रवाई क्षमता चाहिएमनाया यदि न्यूरॉन व्यवहार्य है. चित्रा 4 एक प्रतिनिधि परिणाम दिखाता है जो 14, 15 में विवरण में चर्चा की है. चित्रा 4 LPeD1 intracellular वर्तमान दालों (नीचे) वर्गीकृत श्रृंखला न्यूरॉन के वोल्ट प्रतिक्रियाओं (ऊपर). 60mV – वर्तमान दालों = VM पर लागू किया गया. समस्या निवारण चढ़ाना से पहले, छवि चिप्स अगर झिल्ली और एपर्चर मलबे से मुक्त होते हैं और चढ़ाना के लिए उपयुक्त हैं निर्धारित करने के लिए. हम एक ईमानदार खुर्दबीन और एक 20x लंबे समय तक काम दूरी उद्देश्य का उपयोग करें. हमारे 1 प्रयोगों के अंतिम सेट में, चिप्स का 67% प्रतिशत सफलतापूर्वक उस तरीके से primed थे. यदि मलबे और / या हवा बुलबुले मौजूद हैं चिप त्याग दें और एक दूसरे की कोशिश करो. विभिन्न सतह (प्लाज्मा) उपचार या कोटिंग्स (PDL, पी आदि), कोशिश की जा सकती है लेकिन सफलता अत्यधिक सेल के प्रकार पर निर्भर हो सकता हैइस्तेमाल किया. giga मुहर और पूरे सेल के गठन के लिए महत्वपूर्ण fluidic समाधान ("विंदुक) की संरचना. समाधान समायोजित, osmolarity, पीएच, और ईओण का मेकअप करने के लिए ध्यान दे. लंबी अवधि संस्कृति के लिए, microfluidic चैनल में मीडिया के साथ शुरू हो, तो समाधान पूर्व कोमल गुरुत्वाकर्षण खिलाया छिड़काव (~ 0.5 मिलीग्राम / मिनट) के माध्यम से रिकॉर्डिंग विंदुक स्विच.

Discussion

NRCC चिप पैच – दबाना पूछताछ मंच उच्च जानकारी सामग्री दवा assays के लिए एक संभावित शक्तिशाली उपकरण है और रोग के इन विट्रो मॉडल में जांच. कांच pipettes की तुलना में अपने फायदे कम उपयोग प्रतिरोध है, जो एक बड़े कोशिकाओं की जांच के लिए एक लाभ है, और कुछ हद तक एक बड़ा समाई के बावजूद छोटे कोशिकाओं के लिए तुलनीय गतिशीलता में परिणाम देगा. एपर्चर जवानों सहज सेल नियमित रूप से प्राप्त किया है, और पूरे सेल प्रविष्टि सहज ¹⁴ देखा गया है. चिप्स और ग्लास विंदुक विधि के बीच एक स्पष्ट अंतर यह है कि सेल संस्कृति पकवान की जांच हिस्सा है और मैन्युअल रूप से कोशिका झिल्ली के साथ संपर्क में नहीं लाया है. संवर्धन कोशिकाओं, कार्यात्मक नेटवर्क का हिस्सा संभवतः, रोग मॉडल के रूप में अधिक biologically प्रासंगिक मॉडल में परिणाम है, और उच्च सेल हासिल करने के लिए ¹⁶ जवानों की जांच के लिए एक अलग तंत्र. हालांकि, सेल निलंबन के साथ इसके विपरीत द्वारा, आकांक्षा cannoजांच पर एक सेल की स्थिति में इस्तेमाल किया जा. घोंघा न्यूरॉन्स, अन्य बड़े कोशिकाओं के रूप में, जांच के शीर्ष पर मैनुअल स्थिति के लिए उत्तरदायी हैं. पर कोशिकाओं के छोटे कोशिकाओं अब संस्कृति समय की आवश्यकता के लिए, हम किसी भी हेरफेर की जरूरत नहीं रही है और जांच की शीर्ष जांच के शीर्ष पर कोशिकाओं के स्थान पर patterning के आसंजन polypeptides द्वारा मुहर प्राप्त करने का एक उच्च संभावना रखने, और प्रदर्शन प्लेसमेंट ^17,18 जांच.

NRCC भी विकसित कर रहा है एक ग्लास विंदुक के बराबर समाई के साथ एक microfluidic के पैच – दबाना ¹⁹ चिप polyimide के. कि परियोजना का अंतिम लक्ष्य एक बहु जांच चिप पैच – दबाना जो कई व्यक्ति आयन ¹⁴ चैनलों के प्रस्ताव पर नेटवर्क व्यवहार में लगे न्यूरॉन्स की electrophysiological गतिविधि के साथ – साथ निगरानी की अनुमति देता है. यह विधि एक उच्च संकल्प – बहु इलेक्ट्रोड 20 arrays के पूरक विधि है.