UPPDRAG LentiPlex Poolade shRNA Bibliotek Screening i däggdjursceller

Summary

Här använder vi ett mänskligt LentiPlex poolad bibliotek och traditionella sekvensering metoder för att identifiera genen mål att främja cellens överlevnad. Vi visar hur du ställer upp och deconvolute en LentiPlex skärm och validera resultaten.

Abstract

RNA-interferens (RNAi) är en inneboende cellulära mekanism för reglering av genuttryck. Utnyttja den inneboende kraften i det här systemet ger oss möjlighet att uttrycka ÖVERVÄLDIGANDE genen nivåer i förlust av studier geners funktion.

Det finns två huvudsakliga metoder för RNAi. Den första är att använda små störande RNA (siRNA) som är kemiskt syntetiserade, och den andra använder kort hårnål RNA (shRNAs) kodats inom plasmider ^1. Det senare kan transfekterade i celler direkt eller förpackade i replikering inkompetent Lentiviral Particles. De främsta fördelarna med att använda Lentiviral shRNAs är det lätt att införande i en mängd olika celltyper, deras förmåga att stabilt integreras i genomet för långsiktig gen ÖVERVÄLDIGANDE och urval, och deras effekt för att bedriva hög genomströmning förlust av funktion skärmar. För att underlätta detta har vi skapat LentiPlex poolade shRNA bibliotek.

MISOutput LentiPlex mänskliga shRNA Poolade Library är en genomet hela Lentiviral poolen produceras med hjälp av en egenutvecklad process. Biblioteket består av över 75.000 shRNA konstruerar från TRC kollektionen riktar sig 15 tusen + mänskliga gener ^2. Varje bibliotek testas för shRNA ombud inför produktlansering för att säkerställa omfattande bibliotek täckning. Biblioteket finns i en färdig att använda Lentiviral format med titrar på minst 5 x 10 ⁸ TU / ml via p24-analys och är redan indelad i tio subpools på ca 8000 shRNA konstruktioner vardera. Förstärkning och sekvensering grundfärger finns även för nedströms mål identifiering.

Tidigare studier etablerat en synergistisk Antitumor aktivitet TRAIL i kombination med paklitaxel hos A549 celler, en människa lungcancer cellinje ^{3, 4.} I denna studie visar vi att tillämpa en poolad LentiPlex shRNA biblioteket för att snabbt genomföra en positiv selektion skärm för gener inblandade i cytotoxicitet of A549 celler när de utsätts för spår och paklitaxel. Ett hinder som ofta uppstår med hög genomströmning skärmar är kostnaden och svårigheten att deconvolution, vi också utförligt en kostnadseffektiv polyklonala metod använder traditionella sekvensering.

Protocol

LentiPlex Poolade Skärminställningar Att identifiera shRNA sekvenser av intresse, är det viktigt att ställa in skärmen så att majoriteten av cellerna får bara en shRNA konstruera. Genom att använda en låg MOI (mångfald av infektion), är sannolikheten för flera integrants per cell kraftigt minskat. Men transduktion effektivitet, och därför vill MOIS del beror på målcellen typ. Därför är det absolut nödvändigt att bestämma den optimala MOI utförs innan skärmen i en ny celltyp. 1. Transduktion Av målceller med uppdraget LentiPlex Pooled shRNA bibliotek Den faktiska MOI som används kommer att variera för olika celltyper. Om replikat önskas då antalet plattor ökas därefter. Dessutom brukar det inte vara fördelaktigt att kombinera de olika subpools. Hålla subpools separata kommer stöd i deconvolution processen. Se till proper märkning av varje vävnadskultur maträtt med subpool nummer som används under transduktion. En låg MOI rekommenderas för att minska sannolikheten för flera integrants per cell. Dag 1 – Seed lämpligt antal av 60-mm rätter med tillräckligt med celler för att få ~ 70% confluency dagen därpå (10 pooler totalt, varje utförd i tre exemplar = 30 rätter totalt). För vår studie var 60 mm rätter ympats med 6 x 105 A549 celler för att uppnå en confluency på 70% före transduktion. Detta säkerställer att cellerna är fortfarande i exponentiell tillväxtfas. Tillväxttakten varierar beroende på celltyp och måste bestämmas innan skärmen. Låt cellerna att följa genom att inkubera över natten vid 37 ° C i en fuktig kuvös i en atmosfär av 5% CO 2. (Valfritt) Ta med ytterligare två 60-mm rätter för transduktion med negativ kontroll shRNAs. Märk disken "Control A" för SHC001H och "Control B" för SHC002H. Dag 2 – Transduce the celler med LentiPlex viruspartiklar. På dagen av transduktion, tina Lentiviral Particles på is. Överför tinade partiklar till ett laminärt flöde huva och hålla på is om den inte används omedelbart. Beräkna hur mycket av varje enskild viral sub-poolen för att lägga till cellerna för att få MOI av 1 på alla rätter cellkultur. Exempel: 1 x 10 6 celler / fat, Viral titer = 5 x 10 8 TU / ml, en önskad MOI 1. i.) 1 x 10 6 celler / fat x (MOI av 1) = 1 x 10 6 transducing enheter (TU) som behövs ii.) 1 x 10 6 TU / (5,0 x 10 8 TU / ml) som erhållits från C A = 2 mikroliter av Lentiviral stamlösning bör läggas till lämplig maträtt. Späd den beräknade mängden virus i 100-300 mikroliter av kompletta media för att säkerställa en bättre spridning av viruset när den läggs till cellodling skålen. Ta bort materialet från pre-seedade celler. Lägg komplett media contaansvara för prövningen hexadimethrine bromid lösning till varje rätt. Den rekommenderade slutliga koncentrationen av hexadimethrine bromid i media är 8 mikrogram / ml. Använd mindre hexadimethrine bromid om du tycker att det är giftigt för din målceller. Lägg shRNA Lentiviral Particles till lämpliga rätter i enlighet med förutbestämda experimentell design. Snurra försiktigt plattorna att fördela viruset i celler. Inkubera 18-20 timmar vid 37 ° C i en fuktig kuvös i en atmosfär av 5% CO 2. (Valfritt) Upprepa 3-8 på samma MOI med SHC001H (tom vektor shRNA Control) i Control Dish A och SHC002H (äggröra shRNA kontroll) i Control skålen B. Behandla dessa rätter identisk med den experimentella rätter under hela försöksperioden. Dag 3 – Ändra media. Aspirera virus-innehållande media och lägga till färska komplett media (utan hexadimethrine bromid). Inkubera cellerna vid 37 ° C över natten. 2. Behandla pläteradeceller med terapeutiska komponent / reagens Dag 4 – Sug media från brunnar och lägg färska media som innehåller terapeutiska komponent på en optimal koncentration. Som med odlingsbetingelser, kommer behandlingar varierar och rätt koncentration och varaktighet skall bestämmas i förväg. I vår studie har vi använt 100 ng / ml TRAIL och 1 mikroM av paklitaxel. Cellerna behandlades i 48 timmar. Överlevande celler bör åter-seedade i T75 kolvar och tillåtas att växa fram nästan 100% konfluenta. (Valfritt) I slutet av urval, inspektera kontroll Dish A och kontroll maträtt B. skålen A och skålen B bör alla ha färre kolonier än åtminstone en av de poolade biblioteket rätter. Om det finns ett oväntat stort antal kolonier i skålen A, än både transduktion processen har påverkat en väg relaterad till önskad fenotyp eller selektiva trycket inte är tillräckligt stark och åter optimering av analysen kan krävas. Om skålen B innehåller alltför många kolonier, Då uttryck av shRNA och engagemang av RNAi väg kan ha en effekt på fenotypen av intresse. Om så är fallet upprepar med SHC001H, för att säkerställa att effekten är inte specifik för SHC002H. 3. Deconvolution från en polyklonal cellpopulation Skörda den heterogena befolkningen i celler från varje subpool och isolera arvsmassans DNA. I vår studie var cellerna tvättade kortfattat i PBS och trypsinized innan genomiska DNA isolerades med GenElute Mammalian Genomic Miniprep kit och medföljande protokoll (Sigma-Aldrich, G1N70). Alternativt kan någon annan genetisk rening kit som för närvarande finns på marknaden användas för isolering av DNA. Det är viktigt att följa protokollet rekommendationer för grundbeloppet för odlade celler. PCR-amplifiering av mål. Den shRNA mall indrivningsförfarandet möjliggör förstärkning av hela pool av shRNA insatser från den markerade cellen befolkningen, eller hämtning av enskildadubbla shRNA mallar från kolonier som individuellt plockades och utvidgas. Efter förstärkning av shRNA insatser från kontroll och markerade celler mål, kan PCR produkter sekvenseras. Denna PCR-amplifiering steg var optimerade med Sigma färdigblandat, Katalognr P2893. Övriga reagenser kan användas för förstärkning, men cykling villkor och / eller magnesium koncentration kan behöva ändras för framgångsrik förstärkning. Förstärkning primers vid koncentrationen 20 mM medföljer LentiPlex satsen. Ställ in PCR-reaktionen som beskrivs i tabell 1. Lägg till komponenterna i angiven ordning. De beskrivna belopp för en 50 mikroliter reaktion. För flera reaktioner, skala de komponenter Master Mix genom att önskat antal reaktioner och inkluderar 10% överskott. Mängden DNA-mall som rekommenderas är 50-100 ng. Det rekommenderas starkt att för en reaktion mallen består av MISSION shRNA mänskliga positiv kontroll Vector utspädd till approprIATE koncentration. Framgångsrika förstärkning med denna mall indikerar att PCR-analys komponenter och villkor cykling är tillräckliga. OBS: För att förhindra överföring kontaminering av experimentella prover och reagenser, föreslås att den positiva kontrollen spädas på en annan plats där efterföljande PCR-reaktioner sätts upp. Spara PCR-program som anges i tabell 2 i din termocykler. För varje prov, kombinera 3 mikroliter PCR-reaktionen med 1 mikroliter av färg och elektrofores tillsammans med 5 mikroliter av DirectLoad ™ PCR-100 bp Låg Ladder, katalognummer D3687 från 1% agarosgel för att bekräfta närvaron av ett 309 bp amplicon. Subcloning av PCR amplicons: PCR-produkter TOPO klonade med TOPO-TA kloning kit, enligt tillverkarens protokollet (Invitrogen, K4575-01). Resultatet är att en PCR-produkt som finns i varje vektor. 250 enskilda kolonier (som vardera innehåller en enskild PCR amplikon) var isolerade och växan i 2 ml kulturer i LB med 100 mg / ml ampicillin. Plasmid DNA extraheras sedan med GenElute Plasmid Miniprep kit (Sigma-Aldrich, PLN70). Renat plasmid DNA kokas med EcoRI och elektroforesbehandlades att bekräfta förekomsten av insatsen. Plasmid DNA-prover har sedan sekvenserat och shRNA sätt identifieras med hjälp av LentiPlex shRNA databas Sequence Sök medföljer LentiPlex bibliotek. 4. Target identifiering och validering Den shRNA sekvensen startar med 5'-GAAACACCGG-3 ". Ange minst de närmaste 10 men mindre än 21 nukleotider som frågan sekvensen i sökrutan på den medföljande shRNA Sequence Sök Access-databas form. Välj arter av poolade shRNA. Du kan också markera subpool från vilken sekvens hittades. Klicka nu på "hitta potentiella Hits"-knappen för att utföra sökningen. Detta ska identifiera motsvarande TRC shRNA sekvens (er) som matchar the sekvensering data. Mer information om TRC shRNA sekvens (er) identifieras och motsvarande gen målen lätt kan hittas på Sigma-Aldrich är din favorit Gene: http://www.sigma.com/yfg Identifierade mål gener ska valideras genom att upprepa den ursprungliga screening-analysen med den ursprungliga TRC klon plus minst ytterligare två shRNAs som riktar sig mot samma gen med hjälp av en 1 shRNA till en väl-format. Sann träffar kommer att visa samma fenotyp i en majoritet av brunnar. 5. Representativa resultat Ett exempel på en poolad LentiPlex skärm arbetsflöde beskrivs i figur 1. Transduced celler som frodats i närvaro av TRAIL och paklitaxel fick expandera tills kolvarna var konfluenta. Genomisk DNA har skördats och utsätts för PCR-amplifiering och kloning som illustreras i figur 1 A, innan den lämnas in för sekvensering och shRNA identifiering enligt Figure 1 C. 250 kloner var ordnat, av dessa 25 var representerade av flera kloner och de återstående 225 var representerade med endast 1 klon och var inte bedrivs vid denna tid. Som visas i figur 2 har flera gener, inklusive TBX3, PPP2CA och EKT2 representeras av flera kloner. T-box transkriptionsfaktor, dök TBX3 i totalt fyra kloner och har varit inblandad i tumören migration 5. PPP2CA nedreglering har visat att upprätthålla tillväxten av LNCaP celler odlade i androgen bristfälliga förhållanden genom att befria de androgen-deprivation-inducerad cell-cykeln arrestera och förhindra apoptos 6. EKT2 är en RAC-beta serin / treonin-proteinkinas och möjliga onkogen visat att spela flera roller i utvecklingen av cancer 7, 8. * Slutlig koncentration av Mg 2 + i lösningen kommer att vara 3 mm;1,5 mm är tillskjutet från Taq färdigblandat och 1,5 mm från magnesiumkloridlösning. Tabell 1. Lentiplex PCR-reaktionen Villkor Tabell 2. Lentiplex PCR-amplifiering Program Figur 1. (A) LentiPlex poolade skärm, (B) Polyklonala deconvolution arbetsflöde, och (c) Identifiering av shRNA mål. A. LentiPlex poolade skärmen. Först Seed celler, sedan lägga shRNA subpools, (10 pooler totalt, varje utförd i tre exemplar för 30 rätter totalt). Därefter behandlas med terapeutiska komponent / reagens (i vårt fall, Trail och Paclitaxel respektive). Sedan reseed överlevande celler i kolvarna och låt att expandera. Harvest heterogen population av celler från varje subpool och isolera arvsmassans DNA. B. Polyklonala deconvolution. PCR för att förstärka DNA innehåller shRNA insatsen. PCR-produkten är enhetlig i storlek, men polyklonala i följd sedan mallen gDNA var också polyklonala. PCR-produkten är klonad i vektor och sedan omvandlas till behöriga bakterier. C. Identifiering av shRNA mål. Individuella kolonier isoleras och plasmid DNA extraheras. Varje klon innehåller kloningsvektor med en enskild PCR-fragment. Plasmid DNA rötas för att bekräfta närvaron av insatsen och sekvenseras. Den shRNA in identifieras med hjälp av LentiPlex shRNA databas Sequence Sök. Figur 2. Identifierade Kandidate gener. 25 gener har identifierats som hade flera träffar. 225 gener hade bara en hit och var inte fortsätta. Vänligen se Kompletterande tabell 1 för en uppdelning av enskilda kloner per kandidat gen. Kompletterande tabell 1. Individuella TRC Bibliotek kloner identifieras Polyklonala Sekvensering Gen ID Träffar upptäckt Clones.

Discussion

I denna studie presenterar vi en genomet hela skärmen för att identifiera gener involverade i cytotoxicitet A549 celler efter paklitaxel / TRAIL behandling. Användningen av en sammanslagen strategi i en genomet bred skärm minskar den tid, kostnad och investeringar i utrustning som normalt förknippas med konventionell klädd skärmar. Kritisk till framgång för skärmen är optimering experiment som utförts i förväg. Transduktion villkor och MOI ska vara empiriskt fastställas.

Urvalsmetoden bör möjliggöra robust urval av celler visa önskad fenotyp (t.ex. överlevnad, ytprotein uttryck, etc). Optimering av dessa parametrar kommer att minska antalet falska upptäckta positiva.

Här var gDNA skördats från huvuddelen populationen av valda celler och sedan TOPO klonade att identifiera enskilda shRNA skär. En möjlig förbättring för detta experiment hade varit att välja för att levande celler med FACS för att säkerställaatt endast levande celler samlas in. De identifierade målen kommer att valideras av transduktion med målspecifik shRNAs i en screening test. Sann träffar kommer att visa den fenotyp i en majoritet av brunnar.

Den LentiPlex Poolade biblioteket är flexibel i sin ansökan. Den är kompatibel med ett brett spektrum av tillämpningar i efterföljande led och kan användas med antingen positivt eller negativt urval strategier. Beroende på screening villkor, deconvolution av shRNA insatser sker via PCR / kloning, microarray, eller nästa generations sekvensering ^{9, 10.} Medan kraften och hastigheten hos dessa tekniker för att deconvolute RNAi-skärmar är väl etablerad, en oro med microarray och nästa generations sekvensering metoder är tillgången på bioinformatik resurser och kunskap som behövs för att korrekt analysera och tolka experimentella resultat. Kostnader i samband med dessa tekniker kan ofta vara ett hinder för företaget om genomet breda skärmar. APCR / kloning ansats, även om den inte lika kraftfullt som microarrays och nästa generations sekvensering är ett effektivt och billigare alternativ.

Agilent erbjuder nu en egen uppsättning baserad på TRC shRNA biblioteket för att ytterligare stöd i LentiPlex skärmar. Dessa alternativ tillåta forskare att använda LentiPlex att studera en mängd olika cellulära funktioner.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalog Number
LentiPlex Pooled Array	Sigma-Aldrich	SHPH01
A549 Cells	ATCC	CCL-185
TRAIL	Sigma-Aldrich	T5694
Paclitaxel	Sigma-Aldrich	T7402
Topo TA Cloning Kit	Invitrogen	K4575-01
JumpStart Taq ReadyMix	Sigma-Aldrich	P2893
GenElute Plasmid Miniprep kit	Sigma-Aldrich	PLN70
EcoR1	New England Biolabs	R0101
hexadimethrine bromide	Sigma-Aldrich	H9268