Procédé pour surveiller l'activité ubiquitine-protéasome dans les cellules vivantes est décrit. Un degron-GFP déstabilisée-(GFP-dgn) et une protéine de fusion GFP-stable dgnFS sont générés et transduites dans la cellule en utilisant un vecteur d'expression lentiviral. Cette technique permet de générer une lignée stable de cellules exprimant GFP-dgn/GFP-dgnFS dans lequel l'activité ubiquitine-protéasome peut être facilement évaluée en utilisant épifluorescence ou la cytométrie en flux.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Suivi de l'activité ubiquitine-protéasome dans les cellules vivantes aide d'un Degron (dgn)-déstabilisé Green Fluorescent Protein Reporter Protéines (GFP) à base de
Dans cet article
Résumé
Résumé
Protéasome est la principale organite intracellulaire impliquée dans la dégradation protéolytique de la anormaux, mal repliées, les protéines endommagées ou oxydées 1, 2. Maintien de l'activité du protéasome est impliqué dans de nombreux processus cellulaires clés, comme la réponse au stress cellulaire 3, la régulation du cycle cellulaire et de la différenciation cellulaire 4 ou en réponse du système immunitaire 5. Le dysfonctionnement du système ubiquitine-protéasome a été associée à l'apparition de tumeurs et de maladies neurodégénératives 4, 6. En outre, une diminution de l'activité du protéasome a été trouvé comme une caractéristique de la sénescence cellulaire et organismique vieillissement 7, 8, 9, 10. Ici, nous présentons une méthode pour mesurer l'activité ubiquitine-protéasome dans les cellules vivantes en utilisant une protéine de fusion GFP-dgn. Pour être en mesure de surveiller l'activité ubiquitine-protéasome dans les cellules vivantes primaires, construit d'ADN complémentaire codant pour une protéine fluorescente verte (GFP)-dgn protéine de fusion (GFP-dgn, instable) et une variante portant une mutation du cadre de lecture (GFP-dgnFS, stable 11) sont insérés dans des vecteurs d'expression lentiviral. Nous préférons cette technique par rapport aux techniques de transfection traditionnels, car il garantit une efficacité de transfection très élevée indépendamment du type de cellule ou de l'âge du donateur. La différence entre la fluorescence émise par la GFP-dgnFS (stable) et la protéine déstabilisé (GFP-dgn) en l'absence ou en présence de l'inhibiteur de protéasome peuvent être utilisées pour estimer l'activité ubiquitine-protéasome dans chaque souche cellulaire particulier. Ces différences peuvent être surveillés par microscopie à épifluorescence ou peut être mesurée par cytométrie en flux.
Protocole
1. Construction des plasmides
- Afin personnalisé oligo-nucléotides codant pour dgn (ACKNWFSSLSHFVIHL 11) et pour dgnFS (HARTGSLACPTSSSICE) et le ligaturer dans le vecteur pEGFP-C1 afin d'obtenir la fusion de la GFP avec dgn / dgnFS (figure 1).
- Amplifier la séquence codant pour la GFP-dgn et GFP-dgnFS par PCR selon le protocole du kit de clonage TOPO directionnel pENTR et continuer avec le kit TOPO directionnel pLenti6/V5 clonage (figure 6).
2. Production de virus
- Le jour avant la transfection (Jour 1) de graines sur les cellules HEK 293FT dans un des flacons....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
La première publication en utilisant la protéine fluorescente verte (GFP) comme substrat reporter pour l'activité ubiquitine-protéasome a été publié en 2000 12. Depuis lors, la GFP est devenu un outil commun de visualiser les activités cellulaires, en particulier le processus ubiquitine-protéasome. Pour surveiller l'activité ubiquitine-protéasome in vivo d'un modèle de souris transgénique avec un rapporteur GFP basée a été mis en place 13. Autres recherches in vivo.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Cette étude a été financée par le Réseau national de recherche sur le vieillissement (PNN S93) par le scientifique autrichien Foundation (FWF), la Commission européenne des projets intégrés et MiMAGE PROTEOMAGE, Pays-Bas Genomics Initiative / Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NGI / NWO, 05040202 et 050 - 060-810 LPN), financé par l'UE réseau d'excellence Durée de vie (FP6 036894) et le Programme de recherche et d'innovation orientée sur la génomique (SenterNovem; IGE01014 et IGE5007).
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Entreprise | Numéro de catalogue | |
| pEGFP-C1 Vecteur | BD Bioscience Clontech | 6084-1 | |
| pENTR Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K2400-20 | |
| pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | V496-10 | |
| Lipofectamine 2000 réactif | Invitrogen | 11668019 | |
| DMEM | Sigma | D5546 | |
| Filtre PVDF (Rotilabo-Spritzenfilter) | Roth | P667.1 | |
| Polyéthylène glycol | Sigma | P2139 | |
| NaCl | Merck | 1.06404.1000 | |
| Phosphate de Dulbecco tamponnée Saline 1x (PBS) | Invitrogen | 14190 | |
| hexadiméthrine bromure de | Sigma | 10,768-9 | |
| Blasticidine | Invitrogen | R21001 | |
| Cristal violet | Sigma | C3886 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | ||
| La streptomycine Pénicilline (Pen-Strep) | Invitrogen | 15140130 | |
| L-glutamine 200 mM | Invitrogen | 25030024 | |
| Sérum foetal bovin (FBS) | Biochrom AG | S0115 | |
| MEM non-acides aminés essentiels (AANE) 100x | Invitrogen | 11140035 | |
| Pyruvate de sodium 100 mM MEM | Invitrogen | 11360039 | |
| D-(+)-glucose (45%) | Sigma | G8769 | |
| Généticine | Invitrogen | 11811023 | |
| CaCl2 | Merck | C5080 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | |
| Trypsine-EDTA (0,05%) | Invitrogen | 25300054 |
Références
- Coux, O., Tanaka, K., Goldberg, A. L. Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes. Annu. Rev. Biochem. 65, 801-847 (1996).
- Davies, K. J. Degradation of oxidized proteins by the 20S proteasome. Biochimi. 83, 301-310 (2001).
- Stangl, K., Stangl, V.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
