Saggio sferoide Misura TGF-β-indotta Invasion
Summary
Un test per misurare quantitativamente fattore di crescita trasformante (TGF)-β-indotta invasione in 3-dimensionale gel collagene è descritto. Questo saggio si avvale della MCF10A serie di linee cellulari, che rappresentano diversi stadi di sviluppo del cancro al seno. Questo metodo può essere adottato per essere utilizzato con altre linee cellulari e può essere utilizzato per indagare altri potenziali attivatori o inibitori di invasione.
Abstract
TGF-β ha opposti ruoli nella progressione del cancro al seno, agendo come un soppressore del tumore nella fase iniziale, ma stimolando l'invasione e metastasi in seguito 1,2 stadio. Inoltre, TGF-β è spesso sovra-espresso nel cancro al seno e la sua espressione correla con prognosi infausta e metastasi 3,4. I meccanismi attraverso i quali TGF-β induce invasione non sono ben compresi.
TGF-β suscita le sue risposte via cellulare di tipo II del TGF-β (TβRII) e di tipo I (TβRI) recettori. Su TGF-β-indotta formazione eteromerici complesso, TβRII fosforila il TβRI. Il TβRI attivato avvii un percorso di segnalazione intracellulare canonica da Smads fosforilazione del recettore (R-Smads), cioè Smad2 e Smad3. Questi attivato R-Smads formare complessi con eteromerici Smad4, che si accumulano nel nucleo e regolano la trascrizione dei geni bersaglio 5. Oltre al già described percorso Smad, i risultati del recettore attivazione attivazione di numerose altre vie di segnalazione non Smad, per esempio mitogeno proteina chinasi attivata (MAPK) percorsi di 6.
Per studiare il ruolo del TGF-β in diversi stadi di cancro al seno, abbiamo fatto uso del sistema a celle MCF10A. Questo sistema è costituito da immortalata spontaneamente MCF10A1 (M1), le cellule epiteliali del seno 7, l'H-RAS trasformato M1-derivato MCF10AneoT (M2), che produce lesioni precancerose nei topi 8, e l'M2-derivato MCF10CA1a (M4), istituito dalla xenotrapianti M2 e forme ad alta carcinomi di grado con la capacità di metastatizzare al polmone 9. Questa serie MCF10A offre la possibilità di studiare le risposte delle cellule con diversi gradi di malignità che non sono viziate da un background genetico diverso.
Per l'analisi di TGF-β-indotta invasione, abbiamo generato homotypic MCF10A sferoide embe colture cellularidded in una matrice di collagene 3D in vitro (Fig. 1). Tali modelli sono molto simili tumori umani in vivo mediante l'istituzione di un gradiente di ossigeno e nutrienti, con conseguente cellule attive e invasivi sulle cellule all'esterno e quiescenti o addirittura necrotico nella parte interna della sferoide 10. Sferoide test basato hanno anche dimostrato di ricapitolare meglio la resistenza ai farmaci di colture monostrato 11. Questo modello MCF10 sistema 3D ci ha permesso di studiare l'impatto di TGF-β segnalazione sulle proprietà invasiva delle cellule del seno in diverse fasi di malignità.
Protocol
Discussion
Abbiamo stabilito un modello di sferoide in cui MCF10A1 cellule e dei suoi derivati maligne invadono in una matrice di collagene in un TGF-β-dipendente. In primo luogo, sferoidi si formano in 96-pozzi di piastre di fondo sospensione rotonda alla presenza di metilcellulosa. Naturalmente, anche a forma di U piatti rivestiti di poli-HEMA può essere utilizzato per questo scopo. Metilcellulosa è assolutamente necessaria in questa fase, poiché le cellule moriranno in assenza di metilcellulosa. TGF-β viene aggiunto …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati a Ken Iwata (OSI Pharmaceuticals, New York, USA) per i reagenti e Fred Miller (Barbara Ann Intitute Karmanos Cancer, Detroit, USA) per le linee cellulari.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| PureCol | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| pH indicator strips | Merck | 9533 | |
| 96-well suspension plates |
Greiner Bio-one | 650 185 | |
| 96-well adhesion TC plates |
Greiner Bio-one | 655 180 |
References
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