Organotypische Slice culturen van embryonale ventrale middenhersenen: Een systeem om Dopaminerge Neuronale Development Study In vitro</em
Summary
Een methode om organotypische segmenten van de E12.5 muriene embryonale middenhersenen genereren is beschreven. De organotypische slice culturen kan worden gebruikt om het gedrag van dopaminerge neuronen of andere ventrale middenhersenen neuronen te observeren.
Abstract
De muis is een uitstekend model organisme om zoogdieren ontwikkeling van de hersenen als gevolg van de overvloed van de moleculaire en genetische gegevens te bestuderen. Echter, de zich ontwikkelende hersenen van muizen is niet geschikt voor eenvoudige manipulatie en imaging in vivo, omdat de muis embryo is ontoegankelijk en ondoorzichtig. Organotypische slice culturen van embryonale hersenen worden dan ook veel gebruikt om de ontwikkeling van de hersenen van muizen in vitro studie. Ex-vivo manipulatie of het gebruik van transgene muizen kan de modificatie van genexpressie, zodat subpopulaties van neuronale of gliale cellen kunnen worden gelabeld met fluorescerende eiwitten. Het gedrag van gelabelde cellen kunnen dan worden waargenomen met behulp van time-lapse imaging. Time-lapse imaging is bijzonder succesvol geweest voor het bestuderen van cel gedrag dat de ontwikkeling van de hersenschors ten grondslag liggen in de late embryonale fase 1-2. Embryonale organotypische slice cultuur-systemen in de hersenen regio's buiten de voorhersenen zijn minder goed EstablisHed. Daarom wordt de rijkdom van time-lapse imaging data beschrijven van neuronale cel migratie beperkt tot de voorhersenen 3,4. Het is nog niet bekend, of de beginselen ontdekt voor de dorsale brein opgaan voor het ventrale hersengebieden. In de ventrale hersenen worden neuronen georganiseerd in neuronale clusters in plaats van lagen en ze hebben vaak ingewikkelde migratie trajecten te ondergaan om hun definitieve standpunt te bereiken. Het ventrale middenhersenen is niet alleen een goed modelsysteem voor ventrale ontwikkeling van de hersenen, maar bevat ook neuronale populaties zoals dopaminerge neuronen die relevant zijn bij de ziekte van processen. Terwijl de functie en de degeneratie van dopaminerge neuronen is onderzocht in detail in de volwassen en de ouder wordende hersenen, is er weinig bekend over het gedrag van deze neuronen tijdens hun differentiatie en migratie fase 5. We beschrijven hier de generatie van de slice culturen uit de embryonale dag (E) 12.5 muis ventrale middenhersenen. Deze slice cultlen zijn potentieel geschikt voor de bewaking dopaminerge neuron ontwikkeling gedurende een aantal dagen in vitro. We belichten de kritische stappen in het genereren van de hersenen plakjes op deze vroege stadia van de embryonale ontwikkeling en discussiëren over de voorwaarden die nodig zijn voor het behoud van een normale ontwikkeling van dopaminerge neuronen in vitro. Presenteren we ook de resultaten van time lapse imaging experimenten. In deze experimenten werden ventrale mesencephalon voorlopers (inclusief de dopaminerge precursoren) en hun nakomelingen geëtiketteerd een mozaïek wijze met een Cre / loxP gebaseerd induceerbaar lot mapping systeem 6.
Protocol
Discussion
De organotypische slice kweekmethode hier wordt gepresenteerd biedt een systeem voor de korte termijn in vitro analyse van de ontwikkeling van dopaminerge neuronen en hun migratie-en projectie routes in de embryonale ventrale middenhersenen. Wij vonden dat er een aantal kritische stappen in het protocol dat zorgvuldig moet worden bijgewoond in om te plakken, dat de normale ontwikkeling van ventrale middenhersenen dopaminerge neuronen maken krijgen. De meest kritische stap is de dissectie van de embryonale herse…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Martine Emond en Isabel Brachmann voor hun hulp bij het vaststellen van de organotypische slice cultuur-systeem en Wolfgang Hübner en Liviu Gabriel Bodea voor de kritische lezing van het manuscript. We willen graag Frank Costantini bedanken voor de R26 reporter muizen en Cliff Tabin voor de Shh Creer muizen. Deze studie werd gefinancierd door een Research Award van het ministerie van Wetenschap en Onderzoek van Noord-Rijnland-Westfalen (Programm zur Förderung der Rückkehr des wissenschaftlichen Spitzennachwuchses aus dem Ausland).
Materials
Table of specific reagents and equipment
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| Glucose 30% | Sigma-Aldrich | G7528-250 | |
| Horse Serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| DMEM (4,5g/L Glc., with L-Gln, Na Pyr, NaHCO3) | Sigma-Aldrich | D6429-500 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Sigma-Aldrich | P4333-20 | |
| L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | prepare 200mM stock and store at -20°C |
| UltraPure LMP agarose | Invitrogen | 15517-022 | |
| Millicel inserts | Millipore | PICMORG50 | |
| μ-dish 35 mm, low | Ibidi | 80136 | |
| Vibratome | Microm | HM 650V | |
| Razor Blade | Plano GmbH | 121-6 | |
| Histoacryl glue | BRAU9381104 | Braun Aesculap | |
| Perforated Spoon Dia diameter 15 mm |
Fine Science Tools | 10370 -18 | |
| Forceps 5 Dumoxel | Fine Science Tools | 11252 – 30 |
Antibodies used for immunostainings:
| Name of the antibody | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Rabbit anti-tyrosine hydroxylase | Millipore | AB152 | Dilution 1:500 |
| Mouse anti-tyrosine hydroxylase | Millipore | MAB318 | Dilution 1:500 |
| Mouse anti-BrdU | BD Pharmingen | 555627 | Dilution 1:200 |
| Rabbit anti-cleaved caspase 3 | Cell Signaling Technology | 9661 | Dilution 1:200 |
| Donkey anti-rabbit IgG-Alexa 488 | Invitrogen | A21206 | Dilution 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG-Cy3 | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | Dilution 1:200 |
References
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat. Neurosci. 7 (2), 136-136 (2004).
- Martini, F. J. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. 136 (1), 41-41 (2009).
- Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2 (2), a001834-a001834 (2010).
- Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. Trekking across the brain: the journey of neuronal migration. Cell. 128 (1), 29-29 (2007).
- Smidt, M. P., Burbach, J. P. How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron. Nat. Rev. Neurosci. 8 (1), 21-21 (2007).
- Legue, E., Joyner, A. L. Genetic fate mapping using site-specific recombinases. Methods. Enzymol. 477, 153-153 (2010).
- Daza, R. A., Englund, C., Hevner, R. F. Organotypic slice culture of embryonic brain tissue. CSH Protoc. , (2007).
- Harfe, B. D. Evidence for an expansion-based temporal Shh gradient in specifying vertebrate digit identities. Cell. 118 (4), 517-517 (2004).
- Srinivas, S. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev. Biol. 1, 4-4 (2001).
- Joksimovic, M. Spatiotemporally separable Shh domains in the midbrain define distinct dopaminergic progenitor pools. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (45), 19185-19185 (2009).
- Blaess, S. Temporal-spatial changes in Sonic Hedgehog expression and signaling reveal different potentials of ventral mesencephalic progenitors to populate distinct ventral midbrain nuclei. Neural. Dev. 6 (1), 29-29 (2011).
- Hippenmeyer, S. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biol. 3 (5), e159-e159 (2005).
