Visualisering af Caenorhabditis elegans Cuticle strukturer ved hjælp af de lipofile Vital Dye, DII
Summary
Vi præsenterer en metode til at visualisere neglebånd i live<em> C. elegans</em> Med den røde fluorescerende lipofile farvestof DII (1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorat), der er almindeligt anvendt i<em> C. elegans</em> At visualisere miljømæssigt udsatte neuroner. Med den optimerede protokol, er alae og ringformede cuticular strukturer plettet af Dii og observeret ved hjælp af sammensatte mikroskopi.
Abstract
De neglebånd af C. elegans er en meget modstandsdygtig struktur, der omgiver det ydre af dyret 1-4. Neglebånd ikke kun beskytter dyr fra miljøet, men også bestemmer kropsform og spiller en rolle i motilitet 4-6. Flere lag, der udskilles af epidermale celler består af neglebånd, herunder en yderste lipid lag 7.
Omkredsen riller i hårstrået kaldes annuli mønster længden af dyret og er til stede i alle faser af udvikling 8. Alae er langsgående kamme, der er til stede under bestemte stadier af udvikling, herunder L1, Dauer og voksne stadier 2,9. Mutationer i gener, som påvirker cuticular kollagen organisationen kan ændre cuticular struktur og dyrs krop morfologi 5,6,10,11. Mens cuticular billeddannelse ved hjælp af sammensatte mikroskopi med DIC optik er muligt, de nuværende metoder, der fremhæver cuticular strukturer omfatter fluorescerendecent transgenet udtryk 12, antistof farvning 13, og elektronmikroskopi 1. Mærket hvedekim agglutinin (WGA) er også blevet brugt til at visualisere cuticular glycoproteiner, men er begrænset i at løse finere cuticular strukturer 14. Farvning af cuticular overflade med fluorescerende farvestof er blevet observeret, men aldrig karakteriseret i detaljer 15. Vi præsenterer en metode til at visualisere neglebånd i levende C. elegans med den røde fluorescerende lipofile farvestof DII (1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorat), der er almindeligt anvendt i C. elegans at visualisere miljømæssigt udsatte neuroner. Dette optimeret protokol til DII farvning er en enkel og robust metode til høj opløsning fluorescerende visualisering af annuli, alae, vulva, mandlige hale, og hermafrodit hale spike i C. elegans.
Protocol
Discussion
Den DII farvningsmetode præsenteres her giver mulighed for forholdsvis hurtig og bekvem måde at visualisere neglebånd i C. elegans. Ved nyorientering og optimere en metode, der almindeligvis anvendes til billede miljømæssigt udsatte sensoriske neuroner 15,17, kan DII bruges til fluorescens plet både alae og ringformede strukturer (figur 1 og 2), samt vulva, mandlige hale, og Hermafrodit hale spike (Figur 3). Vi har konstateret, at inkubationstid løsning og tid indflydelse på evne til DII kons…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke S. Taneja-Bageshwar, K. Beifuss, S. Kedroske, og HC. Hsiao for nyttige diskussioner. Dette arbejde blev finansieret af startfonde fra TAMHSC Institut for Molekylær og Cellulær Medicin. Den sammensatte omfang og spinning disk blev købt med midler fra afdelingen og TAMHSC Kontor dekanen. Nogle stammer, blev tilvejebragt af Caenorhabditis Genetik Center, som er finansieret af National Center for Research Resources. pRF4 (rol-6 (su1006)) var en gave fra A. Fire.
Materials
| Reagents | Synonyms | Company | Catalogue number | Comments |
| DiI | 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Biotium, Inc. | 60010 | Stock dilution: 20 mg/mL in DMF working dilution: 30 mg/mL |
| DMF | Dimethylformamide | Sigma-Aldrich, Inc. | D4551 | |
| Triton X-100 |
Octylphenoxypolyethoxyethanol | VWR International, LLC. | EM-9410 | |
| M9 | 22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1mM MgSO4 | |||
| NGM | Nematode growth medium | IPM Scientific, Inc. | 11006-501 | Can be prepared following NGM agar protocol18 |
| Agar-agar | EMD Chemicals, Inc. | 1.01614 | 4% in water | |
| Levamisole | Levamisole hydrochloride | Sigma-Aldrich, Inc. | 31742 | 100 μM – 1 mM levamisole as required |
| Microscope slides | VWR International, LLC. | 16005-106 | ||
| Microscope cover glasses | VWR International, LLC. | 16004-302 | ||
| Compound scope | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objectives to match the needs of the experiment | |
| TRITC or other compatible filter | Chroma Technology Corp. | 49005 | ET – DSRed (TRITC/Cy3) sputtered filter set |
References
- Cox, G. N., Kusch, M., Edgar, R. S. Cuticle of Caenorhabditis elegans: its isolation and partial characterization. The Journal of Cell Biology. 90, 7-17 (1981).
- Cox, G. N., Staprans, S., Edgar, R. S. The cuticle of Caenorhabditis elegans. II. Stage-specific changes in ultrastructure and protein composition during postembryonic development. Dev. Biol. 86, 456-470 (1981).
- Hall, D., Altun, Z. . C. elegans Atlas. , (2008).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. The C. elegans Research Community. , (2007).
- Kramer, J. M., Johnson, J. J., Edgar, R. S., Basch, C., Roberts, S. The sqt-1 gene of C. elegans encodes a collagen critical for organismal morphogenesis. Cell. 55, 555-565 (1988).
- Mende, N. v. o. n., Bird, D. M., Albert, P. S., Riddle, D. L. dpy-13: a nematode collagen gene that affects body shape. Cell. 55, 567-576 (1988).
- Blaxter, M. L. Cuticle surface proteins of wild type and mutant Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 268, 6600-6609 (1993).
- Costa, M., Draper, B. W., Priess, J. R. The role of actin filaments in patterning the Caenorhabditis elegans cuticle. Dev. Biol. 184, 373-384 (1997).
- Sapio, M. R., Hilliard, M. A., Cermola, M., Favre, R., Bazzicalupo, P. The Zona Pellucida domain containing proteins, CUT-1, CUT-3 and CUT-5, play essential roles in the development of the larval alae in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol.. 282, 231-245 (2005).
- Johnstone, I. L. Cuticle collagen genes. Expression in Caenorhabditis elegans. Trends Genet. 16, 21-27 (2000).
- Kramer, J. M., French, R. P., Park, E. C., Johnson, J. J. The Caenorhabditis elegans rol-6 gene, which interacts with the sqt-1 collagen gene to determine organismal morphology, encodes a collagen. Mol. Cell Biol. 10, 2081-2089 (1990).
- Thein, M. C. Caenorhabditis elegans exoskeleton collagen COL-19: an adult-specific marker for collagen modification and assembly, and the analysis of organismal morphology. Dev. Dyn. 226, 523-539 (2003).
- McMahon, L., Muriel, J. M., Roberts, B., Quinn, M., Johnstone, I. L. Two sets of interacting collagens form functionally distinct substructures within a Caenorhabditis elegans extracellular matrix. Molecular Biology of the Cell. 14, 1366-1378 (2003).
- Link, C. D., Ehrenfels, C. W., Wood, W. B. Mutant expression of male copulatory bursa surface markers in Caenorhabditis elegans. Development. 103, 485-495 (1988).
- Tong, Y. G., Burglin, T. R. Conditions for dye-filling of sensory neurons in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. Methods. 188, 58-61 (2010).
- Singh, R. N., Sulston, J. E. Some observations on moulting in Caenorhabditis elegans. Nematologica. 24, 63-71 (1978).
- Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans. Génétique. 148, 187-200 (1998).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Génétique. 77, 71-94 (1974).
