Visualisering av Caenorhabditis elegans Cuticle strukturer med hjälp av den lipofila Vital Dye, DII
Summary
Vi presenterar en metod för att visualisera nagelband i levande<em> C. elegans</em> Använda röda fluorescerande lipofila färg DII (1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perklorat), som ofta används i<em> C. elegans</em> Att visualisera miljömässigt utsatta nervceller. Med denna optimerat protokoll, är alae och ringformiga cuticular strukturer färgas av DII och observerade med hjälp av sammansatta mikroskopi.
Abstract
Nagelbanden av C. elegans är en mycket motståndskraftig struktur som omger utsidan av djuret 1-4. Nagelbanden inte bara skyddar djur från miljön, men också avgör kroppsform och spelar en roll i motilitet 4-6. Flera lager utsöndras av epidermal celler består av nagelband, inklusive en yttersta lipid skikt 7.
Perifera åsar i nagelbanden kallas annuli mönster längden på djuret och är närvarande vid alla stadier av utveckling 8. Alae är längsgående åsar som finns under vissa stadier av utveckling, inklusive L1, Dauer, och scener vuxna 2,9. Mutationer i gener som påverkar cuticular kollagen organisation kan förändra cuticular struktur och djurkroppen morfologi 5,6,10,11. Medan cuticular avbildning med hjälp av sammansatta mikroskopi med DIC optik är möjligt, nuvarande metoder som framhäver cuticular strukturer omfattar lysrörprocent transgens uttryck 12, antikroppar färgning 13, och elektronmikroskopi 1. Märkta vetegroddar agglutinin (WGA) har också använts för att visualisera cuticular glykoproteiner, men är begränsad till att lösa finare cuticular strukturer 14. Färgning av cuticular yta med hjälp av fluorescerande färg har observerats, men aldrig karakteriseras i detalj 15. Vi presenterar en metod för att visualisera nagelband i levande C. elegans med röda fluorescerande lipofila färg DII (1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perklorat), som ofta används i C. elegans att visualisera miljömässigt utsatta nervceller. Detta optimerat protokoll för DII färgning är en enkel, robust metod för högupplösta fluorescerande visualisering av annuli, alae, vulva, manliga svans, och hermafroditer svans spik i C. elegans.
Protocol
Discussion
Den DII färgningsmetod presenteras här ger en relativt snabbt och bekvämt sätt att visualisera nagelbanden i C. elegans. Genom att återanvända och optimera en metod som ofta används för att bilden miljömässigt utsatta sensoriska neuroner 15,17, kan DII användas till fluorescerande färg både alae och ringformiga strukturer (figur 1 och 2) samt vulva, manliga svans, och hermafroditer svans spik (Figur 3). Vi har funnit att inkubationstiden lösningen och tid påverka förmågan av DII kons…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka S. Taneja-Bageshwar, K. Beifuss, S. Kedroske, och HC. Hsiao för bra diskussioner. Detta arbete har finansierats av start-up medel från TAMHSC Institutionen för molekylär och cellulär medicin. Substansen omfattning och spinning disk har köpts med medel från institutionen och TAMHSC kontoret för Dean. Vissa stammar lämnades av Caenorhabditis Genetics Center, som finansieras av National Center for Research Resources. pRF4 (rol-6 (su1006)) var en gåva av A. Fire.
Materials
| Reagents | Synonyms | Company | Catalogue number | Comments |
| DiI | 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Biotium, Inc. | 60010 | Stock dilution: 20 mg/mL in DMF working dilution: 30 mg/mL |
| DMF | Dimethylformamide | Sigma-Aldrich, Inc. | D4551 | |
| Triton X-100 |
Octylphenoxypolyethoxyethanol | VWR International, LLC. | EM-9410 | |
| M9 | 22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1mM MgSO4 | |||
| NGM | Nematode growth medium | IPM Scientific, Inc. | 11006-501 | Can be prepared following NGM agar protocol18 |
| Agar-agar | EMD Chemicals, Inc. | 1.01614 | 4% in water | |
| Levamisole | Levamisole hydrochloride | Sigma-Aldrich, Inc. | 31742 | 100 μM – 1 mM levamisole as required |
| Microscope slides | VWR International, LLC. | 16005-106 | ||
| Microscope cover glasses | VWR International, LLC. | 16004-302 | ||
| Compound scope | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objectives to match the needs of the experiment | |
| TRITC or other compatible filter | Chroma Technology Corp. | 49005 | ET – DSRed (TRITC/Cy3) sputtered filter set |
References
- Cox, G. N., Kusch, M., Edgar, R. S. Cuticle of Caenorhabditis elegans: its isolation and partial characterization. The Journal of Cell Biology. 90, 7-17 (1981).
- Cox, G. N., Staprans, S., Edgar, R. S. The cuticle of Caenorhabditis elegans. II. Stage-specific changes in ultrastructure and protein composition during postembryonic development. Dev. Biol. 86, 456-470 (1981).
- Hall, D., Altun, Z. . C. elegans Atlas. , (2008).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. The C. elegans Research Community. , (2007).
- Kramer, J. M., Johnson, J. J., Edgar, R. S., Basch, C., Roberts, S. The sqt-1 gene of C. elegans encodes a collagen critical for organismal morphogenesis. Cell. 55, 555-565 (1988).
- Mende, N. v. o. n., Bird, D. M., Albert, P. S., Riddle, D. L. dpy-13: a nematode collagen gene that affects body shape. Cell. 55, 567-576 (1988).
- Blaxter, M. L. Cuticle surface proteins of wild type and mutant Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 268, 6600-6609 (1993).
- Costa, M., Draper, B. W., Priess, J. R. The role of actin filaments in patterning the Caenorhabditis elegans cuticle. Dev. Biol. 184, 373-384 (1997).
- Sapio, M. R., Hilliard, M. A., Cermola, M., Favre, R., Bazzicalupo, P. The Zona Pellucida domain containing proteins, CUT-1, CUT-3 and CUT-5, play essential roles in the development of the larval alae in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol.. 282, 231-245 (2005).
- Johnstone, I. L. Cuticle collagen genes. Expression in Caenorhabditis elegans. Trends Genet. 16, 21-27 (2000).
- Kramer, J. M., French, R. P., Park, E. C., Johnson, J. J. The Caenorhabditis elegans rol-6 gene, which interacts with the sqt-1 collagen gene to determine organismal morphology, encodes a collagen. Mol. Cell Biol. 10, 2081-2089 (1990).
- Thein, M. C. Caenorhabditis elegans exoskeleton collagen COL-19: an adult-specific marker for collagen modification and assembly, and the analysis of organismal morphology. Dev. Dyn. 226, 523-539 (2003).
- McMahon, L., Muriel, J. M., Roberts, B., Quinn, M., Johnstone, I. L. Two sets of interacting collagens form functionally distinct substructures within a Caenorhabditis elegans extracellular matrix. Molecular Biology of the Cell. 14, 1366-1378 (2003).
- Link, C. D., Ehrenfels, C. W., Wood, W. B. Mutant expression of male copulatory bursa surface markers in Caenorhabditis elegans. Development. 103, 485-495 (1988).
- Tong, Y. G., Burglin, T. R. Conditions for dye-filling of sensory neurons in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. Methods. 188, 58-61 (2010).
- Singh, R. N., Sulston, J. E. Some observations on moulting in Caenorhabditis elegans. Nematologica. 24, 63-71 (1978).
- Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans. Génétique. 148, 187-200 (1998).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Génétique. 77, 71-94 (1974).
