מאמר זה מתאר שיטה צדדי כדי ליצור תאים שמקורם ברקמה טבעות על ידי הרכבה עצמית הסלולר. לתאי שריר חלק seeded לתוך בצורת טבעת המצרפי בארות agarose חוזה ליצירת חזקים תלת ממדי (3D) ברקמות בתוך 7 ימים. מילימטר בקנה מידה טבעות רקמה תורמת בדיקות מכניות לשמש כאבני בניין להרכבת רקמות.
בכל שנה, מאות אלפי חולים לעבור ניתוח מעקפים בעורק בארצות הברית. 1 כשליש מהחולים הללו אין כלי מתאים התורם עצמיים בשל התקדמות המחלה או הקציר הקודם. מטרתה של הנדסת רקמות כלי דם היא לפתח מקור חלופי מתאים אלה שתלי לעקוף. בנוסף, רקמת כלי דם מהונדסים עשויים להביא תועלת כמו החיים דגמים של כלי הדם כדי לחקור מחלות לב וכלי דם. מספר גישות מבטיחות לכלי הדם הנדסה נחקרו, עם מחקרים עדכניים רבים מתמקדת בפיתוח וניתוח של תא המבוססת על שיטות. 2-5 בזאת, אנו מציגים שיטה במהירות עצמית להרכיב תאים לטבעות רקמה 3D כי ניתן להשתמש במבחנה למודל רקמות כלי דם.
כדי לעשות זאת, השעיות של בתאי שריר חלק הם זורעים לתוך עגול תחתית טבעתי agarose בארות. לא דבק המאפיינים של agarose לאפשר הבתאי הדואר להתיישב, המצרפי חוזה סביב לפרסם במרכז היטב כדי ליצור טבעת רקמה מלוכדת. 6,7 טבעות אלה יכולים להיות מתורבת במשך כמה ימים לפני קציר מכני עבור ניתוח, פיזיולוגית ביוכימית או היסטולוגית. הראינו כי אלה תאים שמקורם ברקמה טבעות התשואה על 100-500 כוח kPa האולטימטיבי מתיחה 8 אשר עולה על הערך דיווח על אחרים מהונדסים בונה רקמת כלי דם בתרבית לתקופות דומות (<30 kPa). 9,10 התוצאות שלנו מראות כי תאים חזקים הנגזרות דור וסקולרית טבעת רקמה יכולה להיות מושגת בתוך פרק זמן קצר, והיא מציעה את ההזדמנות להערכה כמותית ישירה של תרומות של תאים תאים שמקורם מטריצה (CDM) על מבנה רקמת תפקוד כלי הדם.
לאחרונה חלה התעניינות מוגברת מבוססי תאים או "פיגום פחות" הנדסת רקמות שיטות כדי לטפל בכמה מגבלות פיגום מבוססי גישות הנדסת רקמות. בהתחשב בכך תאים שמקורם ברקמות נוצרות בתאים המטריצה שהם מייצרים, הם מטבעם מכילים הרבה יותר גבוה צפיפות התא, אינם מכילים חומרים אקסוגניים, והוא יכול להיות עשוי כולו מ תאים חלבונים אנושיים. שתלי כלי דם העשויים תאים אנושיים יכולים להשיג חוזק מכני ניכר בהעדר פיגומים חיצוניים (למשל, לחצים פרץ 3400 מ"מ כספית לעומת 1600 מ"מ כספית עבור ורידים saphenous אדם) 12. למרות מבוססי תאים ורקמות כלי דם התערוכה צפיפות התאים שיפור חוזק מכני, שיטות ייצור העדכניים ביותר (כגון "הנדסה גיליונות מבוסס" 3,4,12 או "bioprinting" 5,13) לדרוש תקופות תרבות ענפה (> 3 חודשים) או ציוד מיוחד לבניית רקמות 3D. תאים שמקורם ברקמה טבעת ספידod המתואר כאן מאפשר מהירות הסלולר הרכבה עצמית ליצירת חזקים בונה רקמת 3D בתוך פרק זמן קצר ללא שימוש בציוד מיוחד.
פרוטוקול זה מפרט את ההליך שפיתחנו כדי ליצור 2 מ"מ קוטר פנימי חולדה חלקה שריר תאים שמקורם ברקמה טבעות. בדוגמה הנוכחית, הטבעות היו בתרבית רקמה במשך 7 ימים (בתרבית אז עבור 7 ימים נוספים לאיחוי טבעת היווצרות צינור). עם זאת, 2 עכברוש מ"מ (אדם) וחלק תא טבעות שרירים ניתן להסיר את בארות והם מלוכדת מספיק לטיפול (למשל, על העברת צינורות סיליקון) מוקדם ככל שיום אחד לאחר זריעת התאים. בנוסף, טבעות רקמות חזקים עם קוטר פנימי משתנה (2, 4 ו 6 מ"מ) ניתן ליצור בשיטה זו פשוט על ידי שינוי בקוטר הודעה של עובש פוליקרבונט המקורי. 8 אנחנו גם שונה לאחרונה את עיצוב תבנית פוליקרבונט כדי לאפשר five 2 זריעת מ"מ בארות להיות יצוק יחידה רב גם agarose קאמרית, אשרמשתמשת פחות PDMS ו agarose, ומתאים באחד היטב צלחת 6-באר (מידע לא מוצג). שינויים בקוטר בהודעה, רוחב של זריעת הבאר, רדיוס העקמומיות של התחתון מעוגל, במספר בארות זריעה, או את העומק של בארות זריעת כולם יכולים להיות שונה פשוט על ידי שינוי מפרטים בקובץ ה-CAD עבור CNC עיבוד של עובש פוליקרבונט. לבסוף, עובש יחיד פוליקרבונט יכול לשמש כדי לפברק מספר בלתי מוגבל של תבניות PDMS, וכל תבנית PDMS ניתן לנקות, autoclaved ולעשות בהם שימוש חוזר עשרות פעמים.
בנוסף לשינוי גודל הטבעות רקמות, עשינו טבעות מהרבה סוגי תאים שונים, כולל: SMCs עכברוש הראשי (יישומים סלולריים, R354-05), אדם יסודי SMCs לב כלילית (Lonza, CC-2583), האדם העיקרי fibroblasts עורי 11 (מתנה נדיבה של סיכות ד"ר ג'ורג', WPI המחלקה להנדסה ביורפואית), ריאות fibroblasts חולדה (RFL-6, ATCC CCL-192), וכן בתאי גזע mesenchymal (Lonza, PT-2501). כל אחד מסוגי אגרגטים תא חוזים סביב שנכתבו למרכז כדי ליצור טבעות רקמות; אף ארגון הסלולר, הרכב ECM, תכונות מכניות של מבנים משתנים לכל סוג תא. הפרמטרים זריעת לכל סוג תא צריכה להיקבע באופן אמפירי מבוסס על גודל התאים ואת יכולתם לצבור. לכן, בעוד המערכת של יצירת תאים שמקורם ברקמה טבעות הוא מאוד תכליתי, פרוטוקול ייתכן שיהיה צורך בהתאמות קלות להיווצרות רקמת אופטימלי עם סוגי תאים שונים.
טבעת הגיאומטריה רקמה מקלה טעינת הערכה קלה של תכונות החומר על ידי בדיקת רקמות מתיחה uniaxial, כמתואר. יש גם תקדים משמעותי באמצעות כלי דם מגזרים טבעת למדוד התכווצות כלי הדם ותפקוד פיזיולוגי. מחקרים ראשוניים מצביעים על תאים שמקורם ברקמה טבעות יכול להיות מותקן על מכשיר myograph חוט למדידת היענות תרופתי ודור התכווצות כוח (מידע לא מוצג). בסך הכל, את היכולת לייצר במהירות עצמית התאספו טבעות תא לניתוח היסטולוגית, מכני, פיזיולוגי, ביוכימי ו מציע כלי חדש רב עוצמה זה עשוי להיות שימושי עבור מודלים מבנה רקמות תפקוד כלי הדם ועל בריאות ומחלה.
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים בתודה ניל Whitehouse (WPI, חנות היגינס Machine) על עזרתו עם מכונות CNC. בנוסף, אנו רוצים להודות אדריאנה הרה (WPI מחשוב ותקשורת מרכז) על עזרתה עם MATLAB תכנות, כמו גם קייט ומשקאות ויוסף Cotnoir (WPI האקדמית Technology Center) לקבלת סיוע עם Camtasia. סופי בורק Jacleen בקר (WPI האקדמית Technology Center) סיפקה קטעי וידאו משלים. עבודה זו מומנה על ידי המכון הלאומי לבריאות (R15 HL097332), את בית הספר לרפואה UMass-WPI מחקר פיילוט יוזמת, איגוד הלב האמריקאי (מלגת מחקר לתואר ראשון JZH), ואת המכון הפוליטכני וורצ'סטר (מחקר לתואר ראשון קיץ לידידות JZH ומוסדיים סטארט כספים MWR).
Name of the reagent/equipment | Company | Catalog # |
---|---|---|
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 |
Agarose | Lonza | 50000 |
DMEM | Mediatech | 15-017-CV |
Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA | A05-201 |
Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30-002-CI |
Digital imaging system | DVT Corporation | Model 630 |
Uniaxial testing machine | Instron | ElectroPuls E1000 |
Edge Detection Software | DVT Corporation | Framework 2.4.6 |