विषयेतर प्रोटीन एक लघु bispecific आत्मीयता टैग द्वारा सुविधा शोधन

Summary

एक उपन्यास और अत्यधिक कुशल दो कदम आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी प्रोटोकॉल विकसित किया गया है और विस्तार में वर्णित है. विधि के दो निहित समानताएं के साथ एक छोटे से शुद्धि टैग पर आधारित है और विभिन्न गुणों के साथ एक लक्ष्य प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू है.

Abstract

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization¹ . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used² . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions³ . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies^1,2.

Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding⁴ , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A⁵, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified⁶ .

The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.

This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination^1,7.

Protocol

1. लक्ष्य gene/ABDz1-tagged संलयन की क्लोनिंग का निर्माण ABDz1 जीन की प्लास्मिड अभिव्यक्ति में लक्ष्य जीन (एक प्लाज्मिड युक्त ABDz1 एक सामग्री हस्तांतरण समझौते के माध्यम से आसानी से उपलब्ध है) के एन टर्मिनल ligation के लिए उपयुक्त प्रतिबंध साइटों द्वारा flanked पीसीआर टुकड़े तैयार. फोड़ना शुद्ध अभिव्यक्ति वेक्टर और एक उपयुक्त प्रतिक्रिया बफर में चुना प्रतिबंध एंजाइमों के साथ पीसीआर टुकड़े. बंधाव से पहले उत्पादों शुद्ध. अभिव्यक्ति हित के जीन युक्त वेक्टर में प्रतिबंधित ABDz1 टुकड़ा कटी घमनी को बांधना और ई. ligation उत्पाद को बदलने कोली (मूल विधि में RR1ΔM15 तनाव 8 इस्तेमाल किया गया था). अगर प्लेटों पर तब्दील कोशिकाओं के चयन के लिए उपयुक्त एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक बिखरा हुआ है. पीसीआर कुछ कालोनियों और अनुक्रम स्क्रीन परिणामस्वरूप डीएनए अनुक्रमण द्वारा अभिव्यक्ति कैसेट सत्यापित करें. एक अनुक्रम verif की एक रात संस्कृति से प्लाज्मिड तैयारआइईडी कॉलोनी और पसंदीदा अभिव्यक्ति तनाव (मूल विधि ई. Rosetta कोलाई (DE3), एक मानव जीन द्वारा इनकोडिंग प्रोटीन के उत्पादन में सुधार के लिए प्लाज्मिड pRARE की मेजबानी में थे इस्तेमाल किया ) को बदलने के लिए. 2. प्रोटीन अभिव्यक्ति Tryptic सोया 5 छ / एल खमीर निकालने और उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक शोरबा के 10 मिलीलीटर में एक ही बैक्टीरियल कॉलोनी टीका लगाना. 150 rpm पर 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात सेते हैं. 100 मिलीलीटर ताजा मध्यम में रातोंरात संस्कृति का एक मिलीलीटर टीका लगाना और प्रोटीन अभिव्यक्ति (मूल 1 isopropyl-β-डी thiogalactoside जब एक लाख operon उपयोग किया गया था मिमी) प्रेरित जब कोशिकाओं को लघुगणकीय विकास के चरण तक पहुँचने. 150 rpm पर 25 पर centrifugation द्वारा डिग्री सेल्सियस रातोंरात फसल और कोशिकाओं सेते हैं. 3. विषयेतर आत्मीयता शोधन 25 मिलीलीटर चलाने बफर (25 मिमी Tris – एचसीएल, 200 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA, 0.05% 20 (w / v) बीच, 8.0 पीएच) में गोली Resuspend और वें बाधितsonication द्वारा 60% के आयाम और 3 मिनट के लिए 1.0/1.0 दालों पर ई कोशिकाओं. नमूना अपकेंद्रित्र और लक्ष्य प्रोटीन युक्त आगे शुद्धि से पहले सतह पर तैरनेवाला (0.45 सुक्ष्ममापी) फिल्टर. या तो एक 1 मिलीलीटर HSA Sepharose स्तंभ या एक स्तंभ एनएचएस सक्रिय, 10 1 / मिलीलीटर मिनट पर एक उपयुक्त प्रोटीन शोधन प्रणाली पर बफर चलाने का स्तंभ मात्रा (CV) के साथ पहले आपूर्तिकर्ता सिफारिशों के अनुसार HSA के साथ युग्मित, समभार बनाना. 0.5 मिलीग्राम / मिनट में बैक्टीरियल lysate लोड और फिर 1 मिलीग्राम / मिनट प्रवाह दर रीसेट. चल बफर बफर धोने के 5 CV (5 मिमी एनएच 4 एसी, 5.5 पीएच) द्वारा पीछा के 5 CV के साथ स्तंभ धो लें . 1 मिलीग्राम / मिनट पर क्षालन बफर (0.5 एम HAC, पीएच 2.5) के साथ नमूना Elute और भिन्न इकट्ठा, 280 एनएम मॉनिटर अवशोषण आगे शुद्धि के लिए eluted चोटी से भिन्न का चयन करने के लिए. उच्चतम प्रोटीन एकाग्रता के साथ भिन्न पूल, ज़रूर चल बफर में दो बार पतला (20 मिमी फॉस्फेट, 150 मिमी NaCl, पीएच 7.2) औरसुनिश्चित करें कि पीएच के आसपास है तटस्थ. 1 Tris – एचसीएल 8 पीएच एम जोड़ें यदि आवश्यक पीएच बढ़ाने के लिए. 0.5 मिलीलीटर / मिनट पर एक 1 मिलीलीटर HiTrap MabSelect ज़रूर स्तंभ ज़रूर चल बफर के 10 CV के साथ equilibrated 1 मिलीग्राम / मिनट पर किया गया है पर नमूना लोड. 1 मिलीग्राम / लदान के बाद मिनट के लिए रीसेट प्रवाह दर. ज़रूर चल रहे बफर के 5 CV (कदम 5) के साथ स्तंभ धो और 0.2 एम HAC, पीएच 2.7 के साथ प्रोटीन elute. संवेदनशील प्रोटीन लक्ष्य के लिए संग्रह पर eluate सीधे कर सकते हैं Tris – एचसीएल के अलावा द्वारा neutralized. यदि chromatographic कदम MabSelect से eluate उलट कर रहे हैं यकीन है कि स्तंभ बफर (3.1 कदम) को चलाने में पतला किया जा सकता है और पीएच 1 Tris – एचसीएल एम के अलावा द्वारा लगभग 8 से वृद्धि हुई है. सामान्य में, संकरा चोटियों जब यकीन है कि मैट्रिक्स दूसरे चरण में कार्यरत है मनाया जाता है. 4. शुद्धता की सोडियम dodecyl सल्फेट polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस पृष्ठ) द्वारा मूल्यांकन एक पर शुद्ध भिन्न लोडएसडीएस पृष्ठ को कम करने और, अगर वांछित, मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा शुद्ध उत्पाद के आणविक वजन का विश्लेषण. यह महत्वपूर्ण है के लिए पूरी तरह से नमूना कम से ABDz1 में एक मुक्त सिस्टीन गैर को कम करने की शर्तों के तहत उत्पाद के dimerization के कारण हो सकता है. 5. प्रतिनिधि परिणाम: सिद्धांत का एक सबूत के रूप में, orthogonal आत्मीयता ABDz1 टैग द्वारा मदद की शुद्धि तीन मानव लक्ष्य प्रोटीन अलग विलेयता कक्षाएं, आणविक भार और isoelectric अंक (तालिका 1) का प्रतिनिधित्व करने के लिए मूल्यांकन किया गया था. ABDz1 जीन आनुवंशिक लक्ष्य जीन इनकार किया गया था और constructs ई. कोलाई में व्यक्त किया गया, चित्रा 2 विधि में लगातार सभी चरणों के लिए एक प्रवाह चार्ट से पता चलता है. Orthogonal प्रोटोकॉल द्वारा शुद्धि के बाद, विभिन्न बिंदुओं पर एकत्र नमूनों एसडीएस पृष्ठ (चित्रा 3) के द्वारा विश्लेषण किया गया. परिणाम स्पष्ट रूप से एक दोहरी टैग और दो अति विशिष्ट शुद्धि चरणों की उपयोगिता दिखा. हालांकि उचित शुद्धता एसी हैप्रारंभिक शुद्धि जैल से देखा के रूप में कदम के बाद से hieved, लगातार कदम के एक बहुत ही शुद्ध अच्छी तरह से अत्यधिक मांग अनुप्रयोगों के लिए अनुकूल उत्पाद पैदावार. चित्रा 1 मिश्रित bispecific ABDz1 टैग के चयन के लिए इस्तेमाल किया पुस्तकालय का डिजाइन. 46 एमिनो एसिड एक स्थिर तीन हेलिक्स बंडल में albumin बाध्यकारी डोमेन परतों और यह मुख्य रूप से दूसरा हेलिक्स में स्थित मानव सीरम albumin के लिए एक बाध्यकारी साइट शामिल हैं. आनुवंशिक रूप से ग्यारह सतह उजागर एमिनो एसिड पहली और तीसरी हेलिक्स में स्थित randomizing करके, एक उपन्यास बंधन सतह इंजीनियर था. ग्यारह पदों में आंकड़ा संकेत कर रहे हैं और Kraulis एट अल के लिए अनुसार गिने 9 . Staphylococcal प्रोटीन Z डोमेन के साथ एक मिश्रित फेज पर व्यक्त पुस्तकालय, bispecific ABDz1 अणु की पहचान की थी की एक डिमर के खिलाफ biopanning के बाद. <iमिलीग्राम alt = "चित्रा 2" src = "/ files/ftp_upload/3370/3370fig2.jpg" /> चित्रा 2. Orthogonal आत्मीयता शुद्धि प्रोटोकॉल के लिए एक सरल प्रवाह चार्ट . एक ABDz1 अनुक्रम युक्त पीसीआर – टुकड़ा (एन टर्मिनली) एक उपयुक्त अभिव्यक्ति वेक्टर में ब्याज की एक जीन के साथ ligated है. ligation उत्पाद ई. तब्दील हो जाता है अनुक्रम सत्यापन और प्लाज्मिड तैयारी के लिए कोलाई . एक अभिव्यक्ति की मेजबानी के लिए परिवर्तन के बाद, पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए एक बड़े पैमाने पर संस्कृति को एक प्रारंभिक रातोंरात संस्कृति से सेट कर दिया जाता है. जीवाणु centrifugation द्वारा harvested रहे हैं और sonication द्वारा lysed बैक्टीरियल लक्ष्य प्रोटीन युक्त lysate उत्पादन. एक निस्पंदन अवशिष्ट ठोस कणों को दूर करने के कदम के बाद, lysate उत्तराधिकार में दो शुद्धि चरणों के दौर से गुजर द्वारा एक तरल हैंडलिंग प्रणाली पर orthogonal आत्मीयता शुद्धि के अधीन है. दोनों शुद्धि चरणों से Eluted चोटियों और नमूना एसडीएस पृष्ठ द्वारा मूल्यांकन शुद्धता का आकलन कर रहे हैं और टी की तुलना मेंवह शुद्धि से पहले lysate. चित्रा 3. लक्ष्य व्यक्त की और ABDz1 साथ संलयन में शुद्ध प्रोटीन का विश्लेषण एसडीएस पृष्ठ. तीन ABDz1, विभिन्न गुणों का प्रतिनिधित्व, और ABDz1 टैग ही संलयन में व्यक्त प्रोटीन के जीवाणु lysate से ली गई नमूनों को एक साथ एक HSA के स्तंभ पर शुद्धि से इसी चोटियों से नमूने एक निश्चित स्तंभ MabSelect द्वारा पीछा के साथ एकत्र किए गए थे (ए) . Lysates से 1-4 लेन HSA – शुद्धि से शुद्धि, 5-8 गलियों (पहला कदम) और MabSelect ज़रूर शुद्धि (दूसरे चरण) से 9-12 गलियों से पहले नमूने का प्रतिनिधित्व करते हैं. ABDz1 141,377 ABDz1-HT875, ABDz1-HT2375 और ABDz1: नमूने निम्न क्रम में लोड कर रहे हैं. इसके अलावा, एक ही एक ही स्तंभों पर रिवर्स क्रम में शुद्ध lysates से अधिग्रहीत नमूनों का विश्लेषण किया गया (बी). लेन lysates शुद्धि, च 4-6 गलियों से 1-3 पहले नमूने का प्रतिनिधित्वरॉम MabSelect (पहला कदम) यकीन है कि शोधन और HSA शुद्धि (दूसरे चरण) से 7-9 गलियों. नमूने में (ए), लेकिन टैग ही शामिल नहीं है के रूप में एक ही क्रम में भरी हुई थी. उन परिणामों से यह स्पष्ट है कि यह दो कदम विधि उच्च शुद्ध प्रोटीन के क्रम में कदम लागू कर रहे हैं चाहे पैदावार. नाम ख लक्ष्य प्रोटीन Uniprot ग आणविक वजन (केडीए) विलेयता वर्ग घ आण्विक वजन संलयन उत्पाद (केडीए) Isoelectric बिंदु संलयन उत्पाद के 141377 B7Z315 17.4 4 23.7 8.5 HT875 P01040 10.8 3 17.1 4.9 HT2375 P00740 8.9 5 15.2 6.8 अकेले ABDz1 टैग की आण्विक वजन 6.3 केडीए isoelectric 6.7 बिंदु है. लक्ष्य प्रोटीन Uniprot प्रोटीन का एक भाग का प्रतिनिधित्व करता है. http://www.uniprot.org . एन टर्मिनल के साथ प्रोटीन टुकड़ा उनकी 6 10 एबीपी की विलेयता वर्ग . तालिका 1. लक्ष्य और ABDz1 टैग के साथ प्रोटीन संलयन उत्पादों एक सिद्धांत के अध्ययन के सबूत में मूल्यांकन . तीन अलग आणविक वजन, विलेयता और isoelectric बिंदु के साथ अद्वितीय मानव प्रोटीन अभिव्यक्ति और शुद्धि के लिए orthogonal आत्मीयता दृष्टिकोण द्वारा चुने गए हैं.

Discussion

orthogonal आत्मीयता शुद्धि यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल लक्ष्य प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला के कुशल शुद्धि के लिए सक्षम बनाता है. एक उपन्यास बंधन सतह के साथ albumin बाध्यकारी डोमेन के निहित बंधनकारी साइट के संयोजन से, एक छोटे से bispecific प्रोटीन टैग विकसित किया गया था. यह बहुत सरल है क्योंकि यह बस और क्लोन कर सकते हैं किसी भी पसंदीदा अभिव्यक्ति वेक्टर में ब्याज की किसी भी प्रोटीन के लिए संलयन में व्यक्त हो टैग का उपयोग. मानक उपकरण ज्यादातर प्रयोगशालाओं में उपलब्ध दो कदम प्रोटीन शुद्धि के लिए नियोजित किया जा सकता है. ABDz1 टैग के समारोह के बाद से करने के लिए कुशलतापूर्वक अपने दो बाध्यकारी सतहों बेनकाब करने के लिए डोमेन के सही तह पर निर्भर करता है, विधि घुलनशील रूप में व्यक्त प्रोटीन के लिए सीमित है और denaturing शर्तों के तहत purifications के लिए अनुकूल नहीं है. को कम एजेंट के बाद से वे ABDz1 MabSelect ज़रूर मैट्रिक्स पर Z डोमेन के लिए बाध्य के साथ हस्तक्षेप से बचा जाना चाहिए.

विषयेतर आत्मीयता purification के पारंपरिक तरीकों के लिए एक उपयोगी विकल्प प्रदान करता है क्रम में के लिए कई मांग अनुप्रयोगों में अत्यधिक प्रोटीन शुद्ध की आवश्यकताओं को संतुष्ट. इसी समय, इस विधि मिश्रित टैगिंग जब विभिन्न शुद्धि रणनीतियों उत्तराधिकार में उपयोग किया जाता है के लिए की आवश्यकता eliminates. एक देशी लक्ष्य प्रोटीन की आवश्यकता होती है अनुप्रयोगों के लिए, एक protease दरार साइट ^ABDz1 संभव टैग 11 के enzymatic हटाने रेंडर करने के लिए शुरू हो सकता है. इसके अलावा, ABDz1 टैग पहली bispecific छोटे और मुड़ा हुआ प्रोटीन डोमेन तारीख वर्णित है. यह अद्वितीय है क्योंकि यह एक शुद्धि रणनीति है कि दो लक्ष्य विशिष्ट आत्मीयता बातचीत पर निर्भर करता है प्रदान करता है. भविष्य में यह उपन्यास bispecific टैग है कि नए बाध्यकारी सतहों कि आसानी से उपलब्ध है और सस्ती chromatographic रेजिन के साथ संगत कर रहे हैं ले विकासशील द्वारा इस अवधारणा का विस्तार करने के लिए दिलचस्प होगा. उदाहरण के लिए, बुनियादी अवशेषों, मैं एक टैग के साथ संगत के साथ albumin बंधन में शामिल एमिनो एसिड की जगहविनिमय क्रोमैटोग्राफी पर प्राप्त किया जा सकता है. एक इसी तरह की अवधारणा Z डोमेन के प्रभारी इंजीनियरिंग द्वारा प्रभावी सिद्ध किया गया ^है _{जेड 12} एसिड ^और _जेड 13 बुनियादी आयनों और कटियन विनिमय के साथ संगत के रूप में जाना जाता है टैग उत्पन्न करने के लिए, क्रमशः.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
E. coli RR1ΔM15	American Type Culture Collection	35102
E. coli Rosetta (DE3)	Novagen	70954
Tryptic soy broth	Difco	211822
Yeast extract	Difco	212720
Vibra cell sonicator	Sonics and materials	–
HSA Sepharose	Pharmacia Biotech	Former product
HiTrap MabSelect SuRe	GE Healthcare	11-0034-93
HiTrap NHS-activated HP column	GE Healthcare	17-0716-01