Décapsidation est une étape essentielle dans la phase précoce du cycle de vie du VIH-1 et est défini comme le démontage de la coquille de capside et la libération des complexes de ribonucléoprotéines virales (vRNP). Ici, nous montrons des techniques pour isoler des noyaux intacts à partir de virions VIH-1 et pour quantifier leur décapsidation In vitro.
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Article de méthode
En décapsidation in vitro du VIH-1 Cores
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le génome des rétrovirus est enfermé dans une capside entourée d'une enveloppe lipidique. Pour lentivirus, comme le VIH-1, la coquille conique capside est composée de protéines CA disposés comme un treillis de l'hexagone. La capside est fermé par 7 pentamères à la fin de large et 5 à l'extrémité étroite du cône 1, 2. Enfermé dans cette coquille capside est le complexe de ribonucléoprotéines virales, et ensemble, ils constituent le cœur.
Suite à la fusion de la membrane virale avec la membrane de la cellule cible, le VIH-1 est libérée dans le cytoplasme. La capside démonte puis en relâchant sans CA de la forme soluble 3 dans un processus appelé décapsidation. La localisation intracellulaire et le calendrier du VIH-1 décapsidation sont mal comprises. Simple substitutions d'acides aminés dans les CA qui modifient la stabilité de la capside également nuire à la capacité du VIH-1 à infecter les cellules 4. Cela indique que la stabilité de la capside est critique pour le VIH-1. VIH-1 décapsidation a été difficile à étudier en raison du manque de disponibilité des tests sensibles et fiables pour ce processus. Nous décrivons ici une méthode quantitative pour l'étude de décapsidation in vitro en utilisant des noyaux isolés de VIH-1 infectieux des particules. L'approche implique l'isolement des noyaux par sédimentation de virions concentrés à travers une couche de détergent et d'un gradient de saccharose linéaire, dans le froid. Pour quantifier décapsidation, les noyaux isolés sont incubées à 37 ° C pour les différents intervalles de temps et ensuite sédimentées par ultracentrifugation. L'étendue de la décapsidation est analysée par la quantification de la fraction du CA dans le surnageant. Cette approche a été employée pour analyser les effets des mutations virales sur le VIH-1 de la stabilité capside 4, 5, 6. Il devrait également être utile pour étudier le rôle des facteurs cellulaires du VIH-1 décapsidation.
Protocole
1. Production de particules de VIH-1
Avant de procéder, vous devez obtenir la permission et suivez les directives du Bureau de la biosécurité de votre institution à travailler dans un établissement agréé pour la biosécurité VIH infectieux. Vous devez vous assurer que les soins et les précautions de sécurité sont suivies pendant le travail dans le laboratoire de biosécurité.
Production de particules de VIH-1 est généralement effectuée par transfection transitoire de cellules 293T avec le VIH-1 ADN proviral en utilisant une méthode de transfection de phosphate de calcium 7, 8. Haute stocks de virus cult....
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Discussion
La méthode décrite ici pour purifier le VIH-1 pour étudier des noyaux décapsidation in vitro est utile pour étudier cette phase du cycle de vie du VIH-1, notamment en raison de l'indisponibilité d'une méthode validée d'analyser le VIH-1 dans les cellules cibles décapsidation. Bien que cette méthode utilise pour purifier l'équilibre ultracentrifugation noyaux, d'autres ont utilisé granulation directe après lyse brièvement avec 1% de Triton-X-100 12, 13 ou granulation à travers un coussin de.......
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Déclarations de divulgation
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Remerciements
VIH-1 des études décapsidation dans le laboratoire Aiken ont été soutenus par des subventions des NIH AI40364, AI50423 et AI076121. Plusieurs matériaux clés, y compris les réactifs utilisés dans le test ELISA p24, ont été fournies par la recherche du NIH sida et du programme de référence, Division du sida, du NIAID, NIH.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Société | Le numéro de catalogue | Commentaires (optionnel) |
| DMEM | Cellgro | 10 à 013-CV | |
| PBS | Cellgro | 21 à 031-CV | |
| Triton-X-100 | Mallinckrodt Baker Inc | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | Acros | 9005-64-5 | |
| 0,25% de trypsine-EDTA | Cellgro | 25 à 053-CI | |
| 2XBBS | Composition: 50mm BES [p H 6,95], 280 mM de NaCl et 1,5 mM Na 2 HPO 4. Ajuster le pH à 6,95à température ambiante. Stériliser par filtration et les stocker en aliquots à -20 ° C. | ||
| D'anticorps de revêtement: anticorps monoclonal pour p24 (183-H12-5C) | NIH AIDS Research and Référence Reagent Program | 3537 | |
| L'anticorps primaire: le VIH-Ig (sérum hyperimmun patient humain) | NIH AIDS Research and Référence Reagent Program | 3957 | |
L'anticorps secondaire: Chèvre anti-IgG humaine, conjuguée à la peroxydase | Pierce | 31130 | |
| Substrat HRP | KPL Inc | 50-76-11 | |
| Immulon 2HB plaques de 96 puits | Thermo Scientific | 3455 | |
| SW32Ti et SW32.1 rotors Ti et ultracentrifugeuse compatibles | Beckman Coulter | ||
| TLA-55 du rotor et ultracentrifugeuse de table | Beckman Coulter | ||
| Haute microtubes de la vitesse | Beckman Coulter | 326823, 358123, 357448 | |
| Auto-Densi fractionnement du gradient de densité de flux | Labconco Corp | 4517000 | |
| Dégradé Ancien | CBS Scientific Co. Inc | GM-20 |
Références
- Ganser, B. K., Li, S., Klishko, V. Y., Finch, J. T., Sundquist, W. I. Assembly and analysis of conical models for the HIV-1 core. Science. 283, 80-83 (1999).
- Li, S., Hill, C. P., Sundquist, W. I., Finch, J. T. Image reconstructions of helical assemblies of the HIV-1 CA protein. Nature.
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Réimpressions et autorisations
