Comparação quantitativa de Cis-Regulamentação elemento (CRE) Atividades em transgênicos Drosophila melanogaster</em

Summary

Variação fenotípica para características podem resultar de mutações em cis-regulatórias elemento (CRE) seqüências que controlam os padrões de expressão gênica. Métodos derivados para uso em Drosophila melanogaster pode comparar quantitativamente os níveis de padrões espaciais e temporais de expressão genética mediada por variantes modificadas ou que ocorre naturalmente CRE.

Abstract

Padrões de expressão gênica são especificados por cis-regulatórias elemento (CRE) seqüências, que são também chamados enhancers ou cis-regulatórias módulos. A CRE típico possui um arranjo de sítios de ligação para proteínas de transcrição vários fatores que conferem uma lógica de regulamentação especificando quando, onde e em que nível o gene regulado (s) é expressa. O conjunto completo de CREs dentro de um genoma animal codifica programa do organismo para o desenvolvimento de ^um, e empírica, bem como estudos teóricos indicam que mutações nos CREs desempenhou um papel proeminente na evolução morfológica ^2-4. Além disso, estudos do genoma humano largo da associação indicam que a variação genética nas CREs contribuir substancialmente para a variação fenotípica ^5,6. Assim, a compreensão da lógica de regulação e como as mutações afetam essa lógica é um objectivo central da genética.

Transgenes repórter fornecer um método poderoso para estudar a função in vivoção de CREs. Aqui, um conhecido ou suspeito seqüência CRE é acoplado ao promotor heterólogo e seqüências que codificam um gene repórter que codifica para uma proteína de produtos facilmente observáveis. Quando um repórter transgene é inserido em um organismo hospedeiro, a actividade do CRE se torna visível na forma da proteína codificada repórter. P-elemento transgênese mediada na mosca da fruta Drosophila espécies (D.) melanogaster ⁷ tem sido usada há décadas para introduzir transgenes repórter para este organismo modelo, embora a colocação de genômica de transgenes é aleatória. Assim, a atividade do gene repórter é fortemente influenciada pela cromatina local e do ambiente gene, limitando comparações CRE para ser qualitativa. Nos últimos anos, o sistema de integração baseado phiC31 foi adaptado para uso em D. melanogaster para inserir transgenes em sítios específicos do genoma ^10/08 pouso. Esta capacidade fez a medição quantitativa do gene e, relevante aqui, a atividade CRE ^13/11 feasible. A produção de moscas de frutas transgênicas podem ser terceirizados, incluindo phiC31 integração baseada, eliminando a necessidade de comprar equipamentos caros e / ou ter proficiência em protocolos de injeção especializados transgene.

Aqui, apresentamos um protocolo geral para avaliar quantitativamente uma atividade CRE, e mostrar como essa abordagem pode ser usada para medir os efeitos de uma mutação introduzida em uma atividade CRE e comparar as atividades das CREs ortólogos. Embora os exemplos dados são de um ativo CRE durante a metamorfose de frutas voar, a abordagem pode ser aplicada a outros estágios de desenvolvimento, as espécies de mosca da fruta, ou organismos modelo. Em última análise, uma utilização mais generalizada desta abordagem para CREs estudo deve avançar a compreensão da lógica de regulação e como a lógica pode variar e evoluir.

Protocol

Visão geral: Este vídeo demonstra um protocolo capaz de medir quantitativamente as atividades gene regulador para o cis-regulatórias elemento (CRE) sequências em Drosophila melanogaster (D.). Este protocolo pode ser usado para comparar as atividades de regulação possuído por: tipo selvagem e formas mutantes CRE, de ocorrência natural CRE alelos encontrados dentro de uma espécie, ou CREs ortólogos entre as espécies divergentes. 1. Site-specific inte…

Discussion

cis-regulatórias elementos codificar o programa de genômica que especifica padrões de expressão gênica e, assim, o processo de desenvolvimento ^1, e são locais importantes para ambas as mutações subjacentes evolução morfológica ^2-4 e variação fenotípica de traços humanos ^5,6,19. Apesar desta importância, a lógica regulamentar para CREs continuam a ser mal compreendido. Uma razão importante para a compreensão desse déficit tem sido a falta de métodos adequados…