Comparación cuantitativa de Cis-Elemento regulador (CRE) Las actividades de transgénicos Drosophila melanogaster</em
Summary
La variación fenotípica de rasgos puede ser consecuencia de mutaciones en cis-elemento regulador (CRE) secuencias de patrones genéticos que controlan la expresión. Métodos derivados de su uso en Drosophila melanogaster cuantitativamente se puede comparar los niveles de la distribución espacial y temporal de la expresión génica mediada por la modificación o naturales variantes CRE.
Abstract
Patrones de expresión génica se especifican por cis-elemento regulador (CRE) de secuencias, que también son llamados potenciadores o módulos cis-reguladoras. Un típico CRE cuenta con un arreglo de sitios de unión de varias proteínas del factor de transcripción que le confieren una lógica de regulación especifica cuándo, dónde y en qué nivel del gen regulado (s) se expresa. El conjunto completo de CRE dentro de un genoma animal codifica el programa del organismo para el desarrollo 1, y empíricos, así como los estudios teóricos indican que las mutaciones en CRE desempeñado un papel destacado en la evolución morfológica 2-4. Por otra parte, los estudios del genoma humano de asociación amplia indican que la variación genética en CRE contribuir sustancialmente a la variación fenotípica 5,6. Por lo tanto, la comprensión de la lógica de regulación y de cómo las mutaciones afectan a esa lógica es un objetivo central de la genética.
Transgenes reportero de proporcionar un método eficaz para estudiar la función in vivoción de la CRES. Aquí una secuencia CRE sabe o se sospecha está acoplado al promotor heterólogo y las secuencias codificadoras de un gen que codifica un producto de proteína fácilmente observables. Cuando un reportero transgén se inserta en un organismo huésped, la actividad de la CRE se hace visible en forma de la proteína codificada reportero. P-elemento de transgénesis mediada por la mosca de la fruta especies de Drosophila (D.) melanogaster 7 ha sido utilizado durante décadas para introducir transgenes reportero en este organismo modelo, aunque la ubicación genómica de los transgenes es aleatorio. Por lo tanto, la actividad del gen está fuertemente influenciada por la cromatina locales y el medio ambiente del gen, lo que limita las comparaciones CRE a ser cualitativa. En los últimos años, el sistema de integración basado phiC31 fue adaptado para su uso en D. melanogaster para insertar los transgenes en el genoma específico lugares de aterrizaje 10/08. Esta capacidad ha hecho que la medición cuantitativa del gen y, pertinente en este caso, la actividad de CRE 11-13 feasible. La producción de moscas de la fruta transgénicas pueden ser subcontratados, incluyendo phiC31 basado en la integración, eliminando la necesidad de adquirir equipos costosos y / o tienen una habilidad especializada en protocolos de inyección transgénica.
A continuación, presentamos un protocolo general para evaluar cuantitativamente la actividad de la CRE, y mostrar cómo este método puede ser usado para medir los efectos de una mutación introducida en la actividad de una CRE y comparar las actividades de la CRES orthologous. Aunque los ejemplos son para un activo CRE durante la metamorfosis mosca de la fruta, el enfoque se puede aplicar a otras etapas de desarrollo, las especies de mosca de la fruta, o de los organismos modelo. En definitiva, un uso más generalizado de este enfoque de la CRE estudio debe avanzar la comprensión de la lógica de regulación y de cómo la lógica puede variar y evolucionar.
Protocol
Discussion
elementos reguladores cis-codificar el programa de genómica que especifica los patrones de expresión génica y de ese modo el proceso de desarrollo 1, y son lugares importantes para ambas mutaciones subyacentes evolución morfológica 2-4 y la variación fenotípica de los rasgos humanos 5,6,19. A pesar de esta importancia, la lógica de regulación de CRE siguen siendo poco conocidos. Una razón importante de este déficit la comprensión ha sido la falta de métodos adecuado…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a: Nicolas Gompel y Benjamin Prud'homme por su contribución al desarrollo de este protocolo, Melissa Williams y cuatro revisores anónimos por los comentarios sobre el manuscrito, la Universidad de Dayton Escuela de Graduados de becas de investigación a la guerra, y la Universidad de Dayton Biología Departamento e Instituto de Investigación (Udri) para apoyar la investigación de TMW. Este trabajo fue apoyado por la Asociación Americana del Corazón subvención 11BGIA7280000 a TMW.
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