Stretching brevi sequenze di DNA con pinzette costante forza assiale ottici

Summary

Illustriamo l'uso di una forza costante pinzette ottiche assiali per esplorare le proprietà meccaniche delle molecole di DNA brevi. Con stiramento DNA assialmente, riduciamo al minimo gli ostacoli sterici e manufatti derivanti convenzionale manipolazione laterale, che ci permette di studiare molecole di DNA più corto ~ 100 nm.

Abstract

Singola molecola tecniche di allungamento del DNA di lunghezze di profilo meno di un kilobasi sono irto di difficoltà sperimentali. Tuttavia, molti interessanti eventi biologici come legame istoni e proteine ​​mediata da loop di DNA ^1,2, si verificano su questa scala di lunghezza. In anni recenti, le proprietà meccaniche del DNA hanno dimostrato di giocare un ruolo significativo nel fondamentali processi cellulari come il confezionamento di DNA in nucleosomi compatti e fibre cromatina ^3,4. Chiaramente, è quindi importante capire le proprietà meccaniche dei brevi tratti di DNA. In questo lavoro forniamo una guida pratica di una tecnica singola molecola tweezing ottica che abbiamo sviluppato per studiare il comportamento meccanico del DNA con lunghezza di contorno più corti a poche centinaia di paia di basi.

L'ostacolo principale che si estende in brevi segmenti di DNA è che convenzionali pinzette ottiche sono generalmente progettati per applicare la forza in un direction laterale alla fase ^5,6, (vedi fig. 1). In questa geometria, l'angolo tra il tallone ed il coprioggetto, a cui il DNA è legato, diventa molto ripida per DNA lunghezza submicron. La posizione assiale deve ora essere rappresentato, che può essere una sfida, e, in quanto l'estensione trascina microsfera più vicino al vetrino, effetti sterici sono migliorate. Inoltre, a causa della asimmetria delle microsfere, prolungamenti laterali genererà diversi livelli di coppia dovuta alla rotazione della microsfera all'interno della trappola ottica poiché la direzione dei cambiamenti forza di reazione durante l'estensione.

Metodi alternativi per il DNA submicron estende correre contro i propri ostacoli unici. Per esempio, una trappola doppio raggio ottico è limitata allo stiramento DNA di circa una lunghezza d'onda, in cui gli effetti di interferenza di punti tra le due trappole e dalla dispersione della luce tra le microsfere iniziano a rappresentare un problema significativo. Sostituzione di una delle trappolecon una micropipetta molto probabilmente soffre di problemi analoghi. Sebbene si possa utilizzare direttamente il potenziale assiale per allungare il DNA, un regime di retroazione attiva sarebbe necessaria per applicare una forza costante e la larghezza di banda di questo è piuttosto limitata, soprattutto a basse forze.

Abbiamo aggirare questi problemi di fondo direttamente tirando il DNA dal vetrino utilizzando una forza assiale costante pinzette ottiche ^7,8. Ciò è ottenuto intrappolando il tallone in una regione lineare del potenziale ottico, in cui la forza ottica è costante la forza che può essere regolato regolando la potenza del laser. Intrappolando all'interno della regione lineare serve anche come un tutto ottico forza-clamp sul DNA che si estende per circa 350 nm in direzione assiale. Abbiamo contemporaneamente compensare la deriva termica e meccanica finemente regolando la posizione della fase in modo che una microsfera riferimento attaccata al vetrino rimane nella stessa posizione e fuoco, unllowing per un periodo di osservazione praticamente illimitata.

Protocol

1. Pinzette di installazione Il fascio di un laser 1064 nm è divisa in due fasci polarizzati ortogonalmente. Uno è usato per manipolare la biomolecola mentre l'altro viene usato per scopi di taratura (vedi fig. 2). L'intensità del fascio di manipolazione è controllato da un acustoottico deflettore (AOD), mentre la posizione e la messa a fuoco di ogni fascio viene controllata indipendentemente da specchi di orientamento del fascio e telescopi ottici, rispettivamente. Le travi ve…

Discussion

Pinzette ottiche convenzionali invocare o retroazione analogica o controllato dal computer per applicare una forza costante su un oggetto rifrangenti. Questi sistemi di feedback attivi hanno difficoltà a svolgere in condizioni in cui sbalzi l'estensione del campione si verificano, per esempio, dal legame di una proteina di DNA o il passo rapido di un motore molecolare lungo un filamento. Vari metodi passivi per applicare forze costanti sono recentemente sviluppate. Un tale metodo, utilizzato per risolvere l'int…

Materials

Reagent/Equipment	Company	Catalog number	Comments
Nd:YVO4 laser	Spectra Physics	T40-Z-106C
Acousto-optic deflector	IntraAction	DTD-274HA6
Microscope Objective	Olympus	PlanApo	60X, NA 1.4
Piezo stage	Mad City Labs	Nano-LP100	XYZ stage
CCD camera	PixeLink	PL-A741
Photodetector	Electro-Optics Tech	ET-3020
Polystyrene Beads	Spherotech	SVP-08-10	800nm, streptavidin coated
Anti-digoxigenin	Roche	11333089001	From sheep
Primers	MWG operon	Custom oligos	One primer: biotin Other : digoxigenin
PCR reagents	New England Biolabs	TAQ polymerase, dNTPs
Coverglass	Fisher Scientific
Other chemicals for buffer	Fisher Scientific

Supplementary Materials

A. Hydrodynamic Friction Coefficient

For determining the hydrodynamic friction coefficient of the microsphere near a surface one can use the following expansion^5,10:

where the following shorthand has been introduced:

The friction coefficient is defined in terms of the fluid viscosity η and the radius of the microsphere, with the microsphere’s center located a distance η above the surface. The summation converges reasonably well when expanded to about ten terms.

B. Influence of Axial Position on Stiffness Calibration

The calibration of the trap stiffness involves a tradeoff between the accuracy of the calibration, which increases with increasing distance from the surface, and the actual axial position where the trap is used experimentally. In general, the trap is calibrated at around 800-1000 nm from the surface, which is higher than the actual experimental condition.

C. Modified Worm-Like Chain (WLC) Model

The force extension curves can be fit to a modified WLC model that accounts for volume exclusion effects at zero optical force as follows:

where F_opt is the optical force, x_o is a fit parameter for the zero force extension,x_opt is the extension under force, l is the contour length of the DNA, and l*_p is a second fit parameter for an “effective” persistence length. F_wlc is given by the usual WLC model¹¹

where ε is the relative DNA extension.