通过细胞周期激酶和磷酸酶活性成比例的FRET监测
Summary
基于FRET的记者越来越多地用于监测活细胞中的激酶和磷酸酶的活动。在这里，我们描述了如何使用基于FRET的记者，以评估目标磷酸化细胞周期依赖性变化的方法。
Abstract
福斯特共振能量转移（FRET）为基础的记者1允许在活细胞中的内源性蛋白激酶和磷酸酶活性的评估。这种探头通常由CFP和YFP的变种，由phosphorylatable序列和磷酸结合结构域进行干预。磷酸化后，探头改变构象，CFP和YFP之间的距离或方向的变化，结果，导致在变化FRET效率（图1）。几个探头在过去十年中，已公布的监测多个激酶和磷酸酶的活性的平衡，其中包括，PKD的5 4 3 PKB，PKC，ERK的6，7 JNK 的 CDK 18， 极光B 9 2，PKA的记者和 PLK1 9 。鉴于模块化设计，额外的探头有可能出现在不久的将来10。
通过细胞周期的进展是受压力signali吴途径11。值得注意的是，不同的细胞周期调节在不受干扰的增长，而当细胞恢复应力 12。定时通过细胞周期的细胞成像，因此需要特别小心。这将成为一个问题，尤其是当用人比例成像，因为两个图像具有很高的信噪比，需要正确地解释结果。成比例的FRET成像细胞周期依赖激酶和磷酸酶活性的变化为主被限制在细胞周期 8,9,13,14分节。
在这里，我们讨论的方法来监视基于FRET的探头使用整个人类的细胞周期的比例成像。方法依赖于设备，是在生命科学领域的许多研究人员，并不需要显微镜或图像处理专业知识。
Protocol
1。探头引入到细胞一个基于FRET的探头和质粒抗共转染的细胞。选择转染的方法，该方法是有效的，在你感兴趣的细胞类型。对于U2OS细胞，标准的磷酸钙转染方法给予足够的结果15。 选择适当的抗生素至少7天的细胞。这丰富的数额细胞表达探头和限制有毒的表达水平，表达水平，严重影响细胞周期的细胞量。 （可选）选择稳定的克隆。 使用固定或活细胞，?…
Discussion
监测苦恼整个细胞周期需要评估短期应对外部刺激时，是同样重要的的考虑。首先，细胞周期的进程很容易扰动压力信号，要求保持在最低限度，光毒性。其次，所有的记者可能影响滴定激酶，磷酸或相互作用域的细胞过程。可能是最简单的方法来评估，如果有足够的实验条件来衡量细胞周期的长度从有丝分裂有丝分裂和独立实验的荧光成像探针表达比较。
在监测的关键因?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者支持由瑞典研究委员会，瑞典战略研究，瑞典癌症协会，瑞典的儿童癌症协会，阿克Wibergs基础和Jeanssons基础的基础。
Materials
| Reagent | Catalogue Number | Company |
| Leibovitz L-15, no phenol red | 21083-027 | GIBCO, by Life Technologies |
| DMEM+Glutamax-I | 31966 | GIBCO, by Life Technologies |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | SV30160.03 | HyClone |
| 0.05% Trypsin EDTA | SH30236.01 | HyClone |
| Penicillin-Streptomycin | SV30010 | HyClone |
| DPBS | 14287 | GIBCO, by Life Technologies |
| Puromycin | P8833 | Sigma-Aldrich |
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KinasePhosphataseCell CycleRatiometric FRETFörster Resonance Energy TransferFRET-based ReportersCFPYFPPhosphorylationConformation ChangeDistanceOrientationFRET EfficiencyProbesPKAPKBPKCPKDERKJNKCdk1Aurora BPlk1Stress Signaling PathwaysProgression Through The Cell CycleUnperturbed GrowthRecovering From StressTime-lapse ImagingSignal To Noise Ratio
Citer Cet Article
Hukasova, E., Silva Cascales, H., Kumar, S. R., Lindqvist, A. Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET. J. Vis. Exp. (59), e3410, doi:10.3791/3410 (2012).