Transretinal ERG Opptak fra Mouse Retina: Rod og Cone Photoresponses
Summary
Vi beskriver en relativt enkel metode for transretinal elektroretinogrammet (ERG) opptak for å få stang og kjegle photoresponses fra intakt mus netthinnen. Denne tilnærmingen tar nytte av blokken av synaptiske overføring fra fotoreseptorene å isolere sine lette svar og ta dem med i felten elektroder plassert over den isolerte flat-montert netthinnen.
Abstract
Det er to forskjellige klasser av image-forming fotoreseptorene i virveldyr netthinnen: stenger og kjegler. Stenger er i stand til å oppdage enkelte fotoner av lys, mens kjegler kontinuerlig drift i henhold til raskt skiftende skarpe lysforhold. Absorpsjon av lys ved stang-og membran-spesifikke visuelle pigmenter i de ytre deler av fotoreseptorene utløser en phototransduction kaskade som til slutt fører til nedleggelse av sykliske nukleotid-gated kanaler på plasmamembranen og celle hyperpolariseringen. Denne lys-indusert endring i membranen nåværende og potensielle kan registreres som en photoresponse, enten klassisk suging elektrode opptaksteknikk 1,2 eller ved transretinal elektroretinogrammet opptak (ERG) fra isolerte netthinne med farmakologisk blokkerte postsynaptiske respons komponenter 3-5. Den siste metoden tillater narkotika-tilgjengelige langvarige opptak fra mus fotoreseptorene og er spesielt nyttig for å oppnå stabile photoresponses from de knappe og skjøre mus kjegler. I tilfelle av kjegler, kan slike eksperimenter utføres både i mørke tilrettelagte forhold og følgende intens belysning som blekemidler i hovedsak all visuell pigment, til å overvåke prosessen med kjeglen fotosensitivitet utvinning i løpet av mørk tilpasning 6,7. I denne videoen viser vi hvordan du utfører stang-og M / L-kjegle-drevet transretinal opptak fra mørk-tilpasset mus netthinnen. Rod opptak vil bli gjennomført ved hjelp av netthinnen av vill type (C57Bl / 6) mus. For enkelhets skyld vil kjegle opptak hentes fra genmodifisert stang transducin α-subenheten knockout (Tα – / -) mus som mangler stang signalering 8.
Protocol
Discussion
Metoden for stang-og membran-drevet transretinal ERG opptak beskrevet ovenfor blir et kraftig verktøy for å undersøke funksjonen av mus fotoreseptorene både villtype og genmodifiserte dyr. I tillegg til enkel karakterisering av grunnleggende photoresponse egenskaper, gir denne enkle teknikken god respons stabilitet under langvarige eksperimenter utført på nært til intakte netthinnen preparater. Både mørk-tilpasset stang maksimal respons amplitude og fotosensitivitet i villtype mus er stabile innen minst 1t fra …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Støttet av Career Development Award fra forskning for å forhindre blindhet, NIH tilskudd EY19312 og EY19543 (VJK), samt av ubegrenset tilskudd fra forskning for å hindre blindhet og EY02687 (Department of Ophthalmology og Visual Sciences ved Washington University).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
| DL-AP-4 | TOCRIS bioscience | 0101 | ||
| All other reagents | Sigma-Aldrich | |||
| Glass capillaries | World Precision Instruments | TW100-4 | For making electrodes | |
| Filter paper | HARG | Millipore | HABG01300 | |
| Photometer | UDT Instruments | S350 | For light calibration | |
| Radiometric silicon sensor | UDT Instruments | 221 | For light calibration | |
| Anti-vibration table | Technical Manufacturing Corporation | TMC 78-239-02R, TMC63-26012-01 | To minimize mechanical noise | |
| Air compressor Panther P 15TC | Werther International | P 15TC | Connected to anti-vibration table | |
| Stereomicroscope | LEICA | MZ9.5 | For mouse eye dissection | |
| Infrared image converters | B.E.Meyers | ProwlerTM | Bound to stereomicroscope | |
| Differential amplifier DP-311 |
Warner Instruments | DP-311 | ||
| Axon Digidata 1440A Digitizer | Molecular Devices | 1440A | ||
| Dual Channel 8-pole Filter | KROHN-HITE Corporation | 3382 | ||
| Ceramic resistor | TE Connectivity | CGS SBCHE618RJ | For reheating the perfusion solution | |
| Thermocouple | T | Physitemp Instruments | IT-18 | |
| Temperature monitor | Omega | DPi32 | Connected to thermocouple | |
| LED 505 nm | TT Electronics/ Optek Technology | Digi-key P/N 365-1185-ND | To apply test flashes/bleaching light | |
| Cautery pen | Bovie | AA25 | For marking the dorsal part of the mouse eyeball | |
| pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition and Analysis Software | Molecular Devices |
References
- Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments. Nature. 269, 78-80 (1977).
- Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings. J. Gen. Physiol. 127, 359-374 (2006).
- Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures. J. Physiol. 567, 923-938 (2005).
- Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina. Vision Res. 48, 264-272 (2008).
- Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161, 487-489 (1968).
- Wang, J. S., Kefalov, V. J. An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle. Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).
- Kolesnikov, A. V., Tang, P. H., Parker, R. O., Crouch, R. K., Kefalov, V. J. The mammalian cone visual cycle promotes rapid M/L-cone pigment regeneration independently of the interphotoreceptor retinoid-binding protein. J. Neurosci. 31, (2011).
- Calvert, P. D. Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13913-13918 (2000).
- Applebury, M. L. The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27, 513-523 (2000).
- Sillman, A. J., Ito, H., Tomita, T. Studies on the mass receptor potential of the isolated frog retina. I. General properties of the response. Vision Res. 9, 1435-1442 (1969).
- Vinberg, F., Koskelainen, A. Calcium sets the physiological value of the dominant time constant of saturated mouse rod photoresponse recovery. PLoS One. 5, e13025-e13025 (2010).
- Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina. Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).
