RNAi de detección para identificar fenotipos postembrionarios en C. elegans</em
Summary
Se describe un método sensible para identificar a los reguladores postembrionario de expresión de la proteína y su localización en<em> C. elegans</em> Con una pantalla de genómica basada en RNAi y un transgén integrado que expresa una proteína funcional, con fluorescencia etiquetados.
Abstract
C. elegans ha demostrado ser un sistema modelo valioso para el descubrimiento y caracterización funcional de muchos genes y 1 vías genéticas. Herramientas más sofisticadas y los recursos para los estudios en este sistema están facilitando continuo descubrimiento de los genes con los fenotipos más sutiles o roles.
Aquí se presenta un protocolo generalizado hemos adaptado para la identificación de C. elegans genes con fenotipos postembrionarios de interés utilizando RNAi 2. Este procedimiento se puede modificar fácilmente para ensayar el fenotipo de elección, ya sea por la óptica de luz o de fluorescencia en un microscopio de disección o compuesto. Este protocolo de cribado saca provecho de los activos físicos del organismo y las herramientas moleculares de la C. elegans comunidad de investigación ha producido. Como un ejemplo, se demuestra el uso de un transgén integrado que expresa un producto fluorescente en una pantalla de ARNi para identificar los genes necesarios para la localización normal de esteproducto en las larvas de fase tardía y adultos. En primer lugar, hemos utilizado una biblioteca genómica disponible en el mercado con el RNAi de larga duración en insertos de cDNA. Esta biblioteca facilita la rápida identificación de los múltiples candidatos por la reducción de RNAi el producto del gen candidato. En segundo lugar, hemos generado un transgen integrado que expresa nuestra proteína fluorecently etiquetado de interés en un fondo de RNAi y minúsculas. En tercer lugar, mediante la exposición de los animales nacidos de RNAi, esta pantalla permite la identificación de los productos de los genes que tienen un papel vital embrionaria que podría ocultar un papel post-embrionario en la regulación de la proteína de interés. Por último, esta pantalla utiliza un microscopio compuesto equipado para la resolución de células individuales.
Protocol
Discussion
El método de cribado ARNi presentado aquí permite un análisis sensible y rápido de los productos de genes necesarios para una normal (o transgénicos) fenotipo postembrionario. El ejemplo que se muestra es una pantalla de genes implicados en la localización subcelular de una proteína fluorescente etiquetados. Sin embargo, este protocolo puede ser modificado para identificar los genes que afectan a otros fenotipos postembrionario de interés.
Este método tiene la ventaja de un enfoque …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer al Dr. Rick Padgett (Waksman Institute, la Universidad de Rutgers, Nueva Jersey) por el don de la DBL-1 cDNA y el Dr. Christopher Rongo (Waksman Institute, la Universidad de Rutgers, Nueva Jersey) por un marcador de la inyección. El laboratorio del Dr. Barth Grant realizó el bombardeo de pistola de genes para la integración de bajo número de copias de la GFP-etiquetados-1 dbl construcción. El laboratorio de René García brindó asistencia técnica durante la creación de texIs100. El René García, Lints Robyn, y Hongmin Qin laboratorios proporcionó asesoramiento productivo. Este trabajo fue financiado por la puesta en marcha de fondos del Departamento de TAMHSC de Medicina Molecular y Celular. El ámbito de aplicación compuesto y confocal de disco giratorio fueron comprados con fondos proporcionados por el departamento y el Colegio TAMHSC de la Oficina de Medicina del Decano.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| NGM Agar | Nematode growth medium | IPM Scientific, Inc | Can be prepared following NGM agar protocol25 |
| M9 Medium | 22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1 mM MgSO4 |
26 | |
| Agar-Agar | EMD Chemicals Inc. | 1.01614.1000 | 2% in water for NGM plates. 4% in water for microscope slide pads (autoclave initially and microwave to melt thereafter). |
| Bacto Peptone | Becton Dickinson – Difco CP | 211677 | 0.25% |
| IPTG | Research Products International Corp. | I56000-5.0 | 1 mM final concentration |
| carbenicillin | Research Products International Corp. | C46000-5.0 | 50 μg/ml working dilution |
| LB Broth Lennox | Becton Dickinson – Difco CP | 240230 | 20 g/liter |
| tetracycline | Sigma | 268054 | 12.5 μg/ml working dilution |
| sodium hypochlorite | Any brand | 5% household bleach | Use fresh bleach. |
| sodium hydroxide | Any Brand | CAS 1310-73-2 | 5 N stock |
| M9 medium | Wormlab Recipe Book | http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab | 26 |
| levamisol | Sigma | 31742 | 100 μM – 1 mM working dilution |
| sodium azide | Fisher Scientific | S227 | 10 mM in M9 working dilution |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | VWR distributor |
| microscope slides | Any brand | 75 x 25 x 1 mm | |
| microscope cover slips | Any brand | 22 x 22 mm No.1.5 | Use the thickness recommended by the microscope manufacturer. |
| compound microscope | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objectives and filters to match the needs of the experiment. |
| media pump | Manostat Varistaltic pump | Kate model #72-620-000 |
Use tubing and settings appropriate for the machine |
References
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