Murint Overflatisk lymfeknute Surgery
Summary
Å følge utviklingen av en immunrespons over tid innenfor samme mus, kan lymfeknuter være sekvensielt fjernes ved operasjon. Her beskriver vi hvordan denne teknikken kan utføres.
Abstract
Innen immunologi, for å forstå utviklingen av en immunrespons mot en vaksine, en infeksjon eller en svulst, er responsen ofte fulgt over tid. Tilsvarende krever studiet av lymfocytt homeostase tidsforløpet eksperimenter. Utføre disse studiene innenfor samme musen er ideelt å redusere den eksperimentelle variabilitet samt antall mus brukes. Blood uttak tillater utførelse av tidsforløpet eksperimenter, men det gir bare informasjon om sirkulerende lymfocytter og gir et begrenset antall celler 1-4. Siden lymfocytter sirkulerer gjennom kroppen og bosatt i lymfeknutene har forskjellige egenskaper, er det viktig å undersøke begge steder. Den sekvensielle fjerning av lymfeknuter ved kirurgi gir en unik mulighet til å følge en immunrespons eller immun celle ekspansjon i samme musen over tid. Videre gir denne teknikken mellom 1-2×10 6 celler per lymfeknute som er tilstrekkelig til å perform fenotypisk karakterisering og / eller funksjonelle analyser. Sekvensiell lymfeknute kirurgi eller lymphadenectomy har blitt brukt av oss og andre 5-11. Her beskriver vi hvordan brakiale og inguinal lymfeknuter kan fjernes ved å lage et lite snitt i huden av en bedøvet mus. Siden operasjonen er overfladisk og gjort raskt, gjenoppretter musa veldig raskt, helbreder godt og ikke opplever overdreven smerte. Annenhver dag, er det mulig å høste en eller to lymfeknuter som åpner for tidsforløpet eksperimenter. Denne teknikken er derfor egnet til å studere egenskapene til lymfeknute-bosatt lymfocytter over tid. Denne tilnærmingen er egnet til ulike eksperimentelle design, og vi tror at mange laboratorier ville ha nytte av å utføre sekvensielle lymfeknute surgeries.
Protocol
Discussion
Vi har beskrevet en protokoll av LN kirurgi som kan gjelde for mange eksperimentelle systemer. Selv om svært nyttig å følge immunreaksjoner eller immun celle homeostase, har denne teknikken noen begrensninger. Først kan kun fire LNS høstes. Andre må immunresponsen studerte være systemisk eller forekommer i de overfladiske lysken eller brakial (hud-drenering) LNS. Endelig er antall celler høstet påvirket av kvaliteten på LN fjerning, en teknisk begrensning som kan bidra til eksperimentell variasjon når absolut…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Sylvie Lesage og alle lab medlemmer for kritisk lesing av protokollen. Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning (MOP-77545) fra den kanadiske Institutes of Health Research (CIHR). Nathalie Labrecque støttes av en FRSQ Senior stipend og Melissa Mathieu fikk en NSERC Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship.
Materials
| Reagent Name | Company | Catalog number | Comments |
| Graefe Fine Pattern Premium Forceps | Harvard Apparatus | 52-2144 | Strongly Curved, 10 cm (4 in), 0.8 mm tip |
| Michel Clip Applying and Removing Forceps | Harvard Apparatus | 52-3779 | 12.5 cm (5 in) |
| Michel Clip 100 | Harvard Apparatus | 52-3746 | 7.5-1.75 mm |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride) | Schering-Plough | ||
| Vetalar (Ketamine hydrochloride) | Boniche Animal Healthcare | DIN: 01989529 | |
| Rompun (Xylazine) | Bayer | DIN: 02169592 | |
| Isoflurane | ABBOTT | DIN: 02032384 | |
| Hypotears eye ointment | Novartis Ophtalmics | DIN: 02133288 | |
| Baxedin (Clorhexidine gluconate 2% in isopropyl alcohol 70%) | Omega | L0000017 | DIN: 02251477 |
References
- Zehn, D., Lee, S. Y., Bevan, M. J. Complete but curtailed T-cell response to very low-affinity antigen. Nature. 458, 211-214 (2009).
- Vezys, V. Memory CD8 T-cell compartment grows in size with immunological experience. Nature. 457, 196-199 (2009).
- Zhou, X. Differentiation and persistence of memory CD8(+) T cells depend on T cell factor 1. Immunity. 33, 229-240 (2010).
- Wirth, T. C., Badovinac, V. P., Zhao, L., Dailey, M. O., Harty, J. T. Differentiation of central memory CD8 T cells is independent of CD62L-mediated trafficking to lymph nodes. J. Immunol. 182, 6195-6206 (2009).
- Rooke, R., Waltzinger, C., Benoist, C., Mathis, D. Targeted complementation of MHC class II deficiency by intrathymic delivery of recombinant adenoviruses. Immunity. 7, 123-134 (1997).
- Witherden, D. Tetracycline-controllable selection of CD4(+) T cells: half-life and survival signals in the absence of major histocompatibility complex class II molecules. J. Exp. Med. 191, 355-364 (2000).
- Labrecque, N. How much TCR does a T cell need. Immunity. 15, 71-82 (2001).
- Leignadier, J., Labrecque, N. Epitope density influences CD8+ memory T cell differentiation. PLoS One. 5, e13740 (2010).
- Leignadier, J., Hardy, M. P., Cloutier, M., Rooney, J., Labrecque, N. Memory T-lymphocyte survival does not require T-cell receptor expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20440-20445 (2008).
- Obst, R., van Santen, H. M., Mathis, D., Benoist, C. Antigen persistence is required throughout the expansion phase of a CD4(+) T cell response. J. Exp. Med. 201, 1555-1565 (2005).
- Bassett, J. D. CD8+ T-cell expansion and maintenance after recombinant adenovirus immunization rely upon cooperation between hematopoietic and nonhematopoietic antigen-presenting cells. Blood. 117, 1146-1155 (2011).
- Lacombe, M. H., Hardy, M. P., Rooney, J., Labrecque, N. IL-7 receptor expression levels do not identify CD8+ memory T lymphocyte precursors following peptide immunization. J. Immunol. 175, 4400-4407 (2005).
- Leignadier, J., Rooney, J., Daudelin, J. F., Labrecque, N. Lowering TCR expression on naive CD8+ T cells does not affect memory T-cell differentiation. Immunol. Cell. Biol. 89, 322-325 (2011).
