我们描述了协议使用<em> C。线虫</em>和RNAi喂养库,可以自动测量多个参数,如荧光,规模和不透明的人口中的个别蠕虫。我们给一个屏幕上的一个例子,以确定在抗真菌先天免疫有关的基因<em> C。线虫</em>。
RNA干扰是一个功能强大的方法来了解基因功能,尤其是当在整个基因组的规模和在定量的情况下进行。 在 C 线虫基因功能可以被撞倒,简单而有效地喂养与对应一个特定的基因1表达双链RNA的细菌的蠕虫。而RNAi技术克隆库的建立覆盖大部分的C.线虫基因组2,3开真正的功能基因组研究(例如4-7)的方式,最成熟的方法是费力。莫伊和他的同事们已经开发出了半自动化的协议,促进全基因组的屏幕8。该方法依赖于显微成像和图像分析。
在这里,我们描述为一种高通量的基因组全屏幕的替代协议,根据机器人细菌RNA干扰克隆,定量分析使用的COPAS的Biosort(联盟Biometrica(充氧))的处理,以及集成软件:MBioLIMS(MODUL生物实验室信息管理系统)技术,提供数据管理和样品跟踪吞吐量增加。该方法允许屏幕固体培养基平板上进行。这是特别重要的一些研究,如处理宿主-病原体相互作用在 C, 线虫 ,因为某些微生物不有效地感染蠕虫液体培养。
我们展示如何使用该方法可用于量化C.先天免疫在抗真菌基因的重要性线虫 。在这种情况下,该方法依赖于利用携带GFP的抗菌肽基因NLP 29的启动和红色荧光记者的控制下表皮感染诱导荧光报告基因,转基因的菌株组成,表示在表皮。后者提供了一个功能完整的表皮的内部控制和非特异性基因沉默9。当控制蠕虫是由真菌感染荧光绿色。 NLP 29日在感染后减弱荧光表达结果需要一个基因的RNAi击倒。目前,该协议允许每周进行测试和分析了3000多RNAi的克隆,开放在不到2个月的全基因组筛选的可能性。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢他们的贡献D. Braendle,CL库尔兹和F.Montañana-桑奇斯。这个项目是由ANR和行政法院区域PACA的,(INSERM)和国家科学研究中心的机构资金补助支持。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
BactoAgar | BD Diagnostic Systems | 214010 | |
Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518 | |
BactoPeptone | BD Diagnostic Systems | 211677 | |
CaCl2 | Any supplier | ||
AeraSeal adhesive film | Dutscher | 760214 | |
Isopropyl β-d-Thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Scientific | AB-0481 | |
K2HPO4 | Any supplier | ||
KH2PO4 | Any supplier | ||
MgSO4 | Any supplier | ||
NaCl | Any supplier | ||
Na2HPO4 | Any supplier | ||
NaOH | Any supplier | ||
96 deep well plate | Thermo Scientific | AB-0932 | |
96 well flat plate | FALCON | 353072 | |
96 well round plate | FALCON | 353077 | |
Tetracycline | Sigma-Aldrich | T8032 | |
Triton X-100 | Any supplier | ||
TECAN robot | TECAN | ||
Liquidator96TM | RAININ | ||
COPAS Biosort | Union Biometrica | ||
LIMS | Modul-Bio |