Ce protocole illustre des méthodes utilisées pour établir des environnements 2D et 3D dans les chambres electrotactic conçus sur mesure, qui permettent de suivre les cellules In vivo / ex vivo En utilisant time-lapse d'enregistrement au niveau cellule unique, afin d'enquêter sur galvanotaxie ou électrotaxie et d'autres réponses cellulaires à diriger à courant continu) des champs électriques (EFS).
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Article de méthode
Champ électrique contrôlé par les migrations des Réalisé cellules progénitrices neurales dans des environnements 2D et 3D
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Endogènes des champs électriques (FE) sont naturellement présents in vivo et jouent un rôle crucial lors de tissus / organes de développement et de la régénération, y compris celle de la 1,2 du système nerveux central. Ces FE endogènes sont générées par la régulation cellulaire de transport ionique combinés à la résistance électrique de cellules et de tissus. Il a été rapporté que le traitement appliqué EF peut favoriser la réparation fonctionnelle des lésions de la moelle épinière chez les animaux et les humains 3,4. En particulier, la migration des cellules EF-dirigée a été démontrée dans une grande variété de types cellulaires 5,6, y compris les cellules progénitrices neurales (PNJ) 7,8. Demande de courant continu (DC) FE n'est pas une technique couramment disponible dans la plupart des laboratoires. Nous avons décrit des protocoles détaillés pour l'application de la FE DC à cultures cellulaires et tissulaires préalablement 5,11. Nous présentons ici une vidéo de démonstration de méthodes standards basées sur une intensité de champ calculée à mettre en place une 2Dd environnements 3D pour les PNJ, et d'enquêter sur les réponses cellulaires à la stimulation EF dans les deux conditions de croissance des cellules simples en 2D, et la tranche cordon organotypique épinière en 3D. Le cordslice épinière est un tissu receveur idéal pour étudier les comportements des PNJ ex vivo, post-transplantation, parce que l'organisation des tissus cytoarchitectoniques est bien conservé au sein de ces cultures 9,10. En outre, ce modèle ex vivo permet également des procédures qui ne sont pas techniquement possible de suivre des cellules in vivo en utilisant time-lapse d'enregistrement au niveau cellule unique. Il est essentiel d'évaluer de façon critique les comportements cellulaires, non seulement dans un environnement 2D, mais aussi dans un état 3D organotypique qui imite l'environnement in vivo. Ce système permettra l'imagerie haute résolution en utilisant la couverture à base de verre plats dans les tissus ou organes de la culture avec un suivi en 3D de la migration cellulaire unique in vitro et ex vivo et peut constituer une étape intermédiaire avant de passer à en viparadigmes VO.
Protocole
1. Neural isolement de cellules souches
- Disséquer cerveaux entiers de E14-16 chez la souris et les placer dans le froid du milieu DMEM/F12 basale. Retirez toutes les méninges sous un microscope anatomique et les cerveaux de transfert dans un plat de 35 mm de Petri.
- Utilisez une pince fine à dissocier mécaniquement cerveaux en fragments de tissus et de les transférer à un tube de 15 ml, puis centrifuger les échantillons à 800 tours par minute pendant 3 min pour éliminer les débris.
- Ajouter DMEM/F12 contenant bFGF et EGF et triturer avec une pipette de 1 ml.
- Passer la suspension de cellules à travers un tamis de cellules pour ob....
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Discussion
Les protocoles que nous utilisons sont basés sur des études antérieures 5,11. L'utilisation de ces méthodes, la culture stable et électrique conditions actuelles peut être maintenue tout en appliquant un EF par des ponts d'agar, la solution de Steinberg, et Ag / AgCl électrodes, à des cellules cultivées ou en tranches dans des chambres electrotactic conçus sur mesure de dimensions normalisées et précis. La profondeur de chambres peut être ajusté pour tenir compte d'échantillon différentes épaisseu.......
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Déclarations de divulgation
Nous n'avons rien à communiquer.
Remerciements
Ce travail a été financé par la subvention de la Société royale URF UF051616, Royaume-Uni et l'European Research Council StG subvention à la norme BS 243261. Le travail en laboratoire est MZ également soutenue par une California Institute of Regenerative Medicine subvention RB1-01417.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
| FGF-base humaine recombinante | Invitrogen | PHG0026 | 20 ng / ml |
| EGF humain recombinant | Invitrogen | PHG0311 | 20 ng / ml |
| N2-Supplément (100X) de liquide | Invitrogen | 02048 | |
| DMEM/F12 (taux élevé de glucose) | Invitrogen | 31330-095 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Naturelle laminine de souris | Invitrogen | 23017-015 | |
| Facteur de croissance réduit la membrane basale Matrix (Matrigel) | BD Biosciences | 354230 | |
| Tampon HEPES | Gibco | 15630 | |
| Tissue chopper McIlwain | Le Laboratoire Mickle Engineering Co Ltd | TC752-PD | |
| Dow Corning graisse silicone de haute-vide | Sigma-Aldrich | Z273554 |
Références
- Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. Wound healing with electric potential. N. Engl. J. Med. 356, 303-303 (2007).
- McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B. Controlling cell behavior electrically: current views and future potential. Physiol. Rev. 85, 943-943 (2005).
- B....
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