שמרים הביקוע,<em> Schizosaccharomyces pombe</em>, היא מערכת מודל טובה ללמוד תהליכים תאיים בסיסיים. כאן אנו מתארים שיטה לבצע ניתוח כמותי תא חי של שמרים ביקוע. בניסוי הספציפי הזה אנחנו מתמקדים בארגון של הגנום תוך גרעין התא, אך השיטה יכולה לשמש גם כדי לחקור גורמים cytosolic.
שיטות מיקרוסקופיה קיימות מספר היום כי ניתן לזהות חלבון מסוים בתוך התא. בעשור האחרון הדמיה תא חי באמצעות fluorochromes כמו חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מחוברת ישירות לחלבון של עניין הפך יותר ויותר פופולרי 1. בעזרת ה-GFP ו fluorochromes דומה localisations subcellular ותנועות של חלבונים ניתן להבחין מיקרוסקופ פלואורסצנטי. יתר על כן, גם לוקליזציה subnuclear באזור מסוים של כרומוזום ניתן ללמוד באמצעות טכניקה זו. ה-GFP הוא התמזגו לחלבון לאק repressor (LacR) והביע ectopically בתא בו חוזר טנדם של רצף לאצו כבר מוכנס לתוך האזור של עניין על כרומוזום 2. LacR-GFP יהיה לאגד את חוזרת לאצו וכי האזור של הגנום יהיה גלוי כנקודה ירוקה מיקרוסקופ פלואורסצנטי. שמרים מתאים במיוחד מאז הומולוגיים עבור סוג זה של מניפולציהרקומבינציה יעילה מאוד, ובכך מאפשרת שילוב ממוקד של חוזר לאצו חלבונים מהונדסים היתוך עם GFP 3. כאן אנו מתארים שיטה לניתוח כמותי של תא חי שמרים ביקוע. פרוטוקולים נוספים עבור ניתוח תא חי של שמרים ביקוע ניתן למצוא, למשל על איך לעשות סרט של 4 התנהגות meiotic כרומוזומליות. בניסוי הספציפי הזה אנחנו מתמקדים בארגון subnuclear וכיצד הוא מושפע במהלך אינדוקציה גן. יש לנו שכותרתו אשכול גנים, בשם Chr1, על ידי כניסתה של אתרי לאצו מחייב בקרבת הגנים. אשכול הגן מועשר עבור גנים המושרה מוקדם במהלך רעב חנקן של שמרים ביקוע 5. בשנת המתח בקרום הגרעין (NM) מסומן על ידי החיבור של mCherry כדי Cut11 NM חלבון והוליד אות ניאון אדום. הפולני ציר הגוף (SPB) הוא תרכובת Sid4 התמזגו חלבון פלואורסצנטי אדום (Sid4-mRFP) 6 </sלמעלה>. בתאי שמרים vegetatively גדל centromeres מחוברים תמיד SPB המוטבע NM 7. SPB מזוהה כמבנה עגול גדול NM. על ידי הדמיה לפני 20 דקות לאחר דלדול של מקור חנקן אנו יכולים לקבוע את המרחק בין באשכול גנים (GFP) ואת NM / SPB. המרחקים אומר או חציון לפני ואחרי דלדול חנקן מושווים ואנחנו יכולים לכמת ולכן אם יש או אין שינוי לוקליזציה subcellular של אשכול הגנים לאחר דלדול חנקן.
בעשור האחרון השימוש הדמיה תא חי כדי לפקח על אירועי הסלולר הפך יותר ויותר פופולרי. זה התחיל עם השימוש של חלבון פלואורסצנטי ירוק של מדוזה Aequorea ויקטוריה ועכשיו fluorochromes שונים זמינים פולטי הקרינה באמצעות ספקטרום רחב של ציאן (475 ננומטר) עד כה אדום (648 ננומטר) 11. אחד היתרונות העיקריים של הדמיה תא חי מעל immunofluorescence היא כי התאים אינם קבועים על ידי פורמלדהיד או אתנול / אצטון טיפול לפני במיקרוסקופ, ומכאן הימנעות חפצים אפשרי מתהליך קיבעון. בנוסף, הדמיה תא חי מציעה את האפשרות לעקוב אחר תאים בודדים לצלם במרווחים תכופים במהלך שעות או ימים של דגירה, כך שניתן לקבל עוד סרטים של אירועים הסלולר 12. בתאי יונקים יש את היתרון של בעל גודל גדול, עם קוטר של כ -100 מיקרומטר, לעומת תא שמרים קטנים בקוטר של 3-4 על &מו: מ ' מצד שני, היתרון הוא עם שמרים הגנום מניפולציות בקלות. הומולוגיים רקומבינציה מתרחשת ביעילות רבה בשמרים והוא משמש הפתיל חלבונים עניין fluorochromes שונה 3. יתר על כן, באמצעות שילוב ממוקד של רצפי לאצו וביטוי הבאות של חלבון LacR-GFP מאפשר זיהוי של חלק מסוים של הגנום תוך גרעין התא 2. באמצעות ס תאים pombe במיקרוסקופ יש יתרונות נוספים שכן הם אורגניזמים unicellular טבעי לגדול עם הזמן דור מהיר בעלות נמוכה תנאי תרבית תאים. יתרה מזאת, ס ' pombe הוא אורגניזם מודל מצוין אוקריוטים שכן יש מטזואניים גנים הומולוגיים.
אחת המגבלות העיקריות של טכניקה זו היא autofluorescence בתא שמרים להפריע לזיהוי של האות נכון. בעיה זו ניתן להתגבר באמצעות התקשורת צמיחה מינימלית עם גלוקוז מעוקרים לסנן במקום autoclaved. בתוךאת השמרים תאים בנוסף צריך להיות מבוגר עבור 2 ימים לפני שלב להיכנס גובר עליהם. הפרוטוקול המובא כאן מציע שיטה פשוטה יחסית, אך עדיין כמותי כדי לקבוע את subcellular לוקליזציה של חלבונים בתוך התא בשמרים. יתר על כן על ידי לצלם בנקודות זמן שונות נוכל לעקוב אירועים הסלולר.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לפרופסור Hiraoka לשליחת לנו זנים. אנו מכירים תמיכה מן גוסטפסון גוראן קרן האגודה למלחמה בסרטן שוודית (2008/939).
Name of reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comment |
Lectin | Sigma | L1395 | |
Silicon grease | Dow Corning | ||
Laser scanning microscope LSM 700 |
Zeiss | LSM 700 | Other confocal microscope could be used. |
SigmaStat3.5 | Statcon | SigmaStat3.5 | Any software for statistical analysis could be used. |