Denna artikel skildrar inspelningen av enskilda celler från fluorescerande taggade neuronala populationer i den intakta musen näthinnan. Genom att använda två-photon infraröd excitation transgenetically märkta celler riktade för patch-clamp in för att studera deras ljus svar, mottaglig egenskaper fältet och morfologi.
Att studera den fysiologiska egenskaper och synapsförbindelser av specifika nervceller i intakt vävnad är en utmaning för de celler som saknar synliga morfologiska egenskaper eller visa en låg befolkningstäthet. Detta gäller särskilt näthinnans amakrina celler, en ovanligt mångskiftande klass av interneuronen som omfattar omkring 30 subtyper hos däggdjur 1. Även att vara en viktig del av den visuella bearbetningen genom att forma retinala utgång 2, har de flesta av dessa subtyper inte studerats hittills på ett funktionellt sammanhang eftersom möter dessa celler med en inspelning elektrod är en sällsynt händelse.
Nyligen har en mångfald av transgen mus linjer som finns att uttrycka fluorescerande markörer som grönt fluorescerande protein (GFP) under kontroll av initiativtagarna till membran receptorer eller enzymer som är specifika för endast en delmängd av nervceller i en viss vävnad 3,4. Dessa pre-märkta celler är därför accessible för att riktade mikroelektrod inriktning i mikroskopisk kontroll, möjliggör systematisk studie av deras fysiologiska egenskaper på plats. Det är dock excitation av fluorescerande markörer tillsammans med risken för fototoxicitet för levande vävnad. I näthinnan är denna metod hindras dessutom av problemet som excitation ljus orsakar lämplig stimulering av fotoreceptorer, och därmed orsakar photopigment blekning och överföring av näthinnans kretsar till ett anpassat ljus-tillstånd. Dessa nackdelar kan övervinnas med hjälp av infraröd excitation levereras av ett läge låst laser i korta pulser av femtosecond sortimentet. Två-foton excitation ger energi tillräckligt för fluoroforen excitation och samtidigt begränsar excitation till en liten vävnad volym minimera riskerna med fotoskador 5. Dessutom lämnar näthinnan mottaglig för visuella stimuli sedan infrarött ljus (> 850 nm) är bara dåligt absorberas av photopigments 6.
<p class = "jove_content"> I den här artikeln visar vi användning av en transgen mus näthinnan att uppnå elektrofysiologiska in situ inspelningar från GFP-uttryckande celler som visuellt är måltavla för två-photon excitation. Näthinnan är beredd och underhålls i mörker och kan utsättas för optiska stimuli som projiceras genom kondensorn i mikroskop (Figur 1). Patch-clamp inspelning av ljus svar kan kombineras med färg fylla avslöja morfologi och att kontrollera för gap junction-medierad färgämne koppling till angränsande celler, så att målcellen kan genom att studera på olika experimentella nivåer.Denna metod ger möjlighet att studera elektriska egenskaper av specifika nervceller i intakta näthinnan i visuell vägledning utan att påverka adaptational skick näthinnan. Det är särskilt lämpade för karakterisering av celler som för närvarande ganska dåligt studerat beror på låg befolkningstäthet som de flesta populationer av amakrina celler. Två-foton excitation tillåter hög upplösning och hög kontrast bildbehandling även från djupare delar av vävnaden 17, en förutsättning för korrekt inriktning och framgångsrika patch-fastspänning av celler i synnerhet i INL med hög täthet av cellens organ.
De isolerade musen näthinnan är lönsamt för 3-4 timmar under experimentella förhållanden. Om den andra näthinnan lagras i totalt mörker under kontinuerlig carbogen gasning, behåller den lila färgen på oblekt photopigment och kan användas efter avslutat experiment med den första näthinnan. I början, med inriktning påcellen med mikropipett i näthinnan wholemount är lite utmanande och kräver lite övning, speciellt vid arbete i mörker. Inklusive en fluorescerande färg i mikropipett kan förenkla förfarandet, eftersom cellen och mikropipett syns under två-photon excitation på samma gång. Kan dock lägga till komponenter till den intracellulära lösningen hindrar gigaseal bildning eller orsaka inspelningskvalitet att lida. När framgång uppnås, kan en bra inspelning pågå i cirka 1 timme
De infraröda excitation ljuset i sig är bara dåligt absorberas av retinala fotoreceptorer, upphetsad GFP-uttryckande celler avger ljus i den synliga delen av spektrumet. Men fluoroforer glada bara i en liten fokus volym som sannolikt inte kommer att ändra adaptational skick näthinnan. Desto mer, magnetisering behövs endast för inriktning och kan stängas av under inspelning av ljus svar.
Den usefulnESS i denna strategi har redan visat studier på specifika populationer av amakrina celler 14,18 från vilken elektrofysiologiska inspelningar annars skulle ha varit möjligt endast genom olyckshändelse 12. Slutligen kan denna kraftfulla teknik ytterligare förlängas genom att ta med en farmakologisk metod 14, Ca 2 + avbildning 19 eller via injiceras celler för immuncytokemiska studier eller elektronmikroskopi. På så sätt kan den funktionella positionen för en viss celltyp i näthinnan kretsar redas ut.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschaft (WE849/16 1 / 2 till KD och RW). Vi är tacksamma för Thomas Euler (Töbingen, Tyskland) för ljuset QDS stimulans programvara.
Reagent/Equip-ment | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
Night-vision goggles | Gutzeit GmbH, Warthausen, Germany | Xtron F1 | includes a 800 nm light source |
Optical filter | Schott, Mainz, Germany | RG9 | longpass filter with cutoff at 690 nm |
Iris scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | curved with 22 mm blade |
Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | straight with 3 mm blade |
Recording chamber | Luigs & Neumann GmbH, Ratingen, Germany | 200-100 500 0180 type A(TC) | Teflon chamber with bottom-mounted glass cover slip (approx. 0.15 mm; No. 200-100 500 0182) |
Flow heater | Multichannel Systems, Reutlingen, Germany | PH01, TC01 | heatable perfusion cannula with temperature sensor and temperature controller |
Laser scanning microscope | Leica Microsystems | DM LFS | controlled by Leica Confocal Software |
Air table | Newport | VH 3036W-OPT | |
Laser | Spectra-Physics | Tsunami Mode-locked Ti:sapphire laser | |
CCD camera | pco AG, Kelheim, Germany | PixelFly QE | including control software |
Micropipette glass capillaries | Hilgenberg, Malsfeld, Germany | 1408411 | |
Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-20004 | fluorescent dye |
Neurobiotin | Axxora | VC-SP-1120-M050 | non-fluorescent tracer |
Streptavidin-Cy3 | Dianova | 016-160-084 | |
Micromanipulator | Luigs & Neumann GmbH, Ratingen, Germany | 210-100 000 0010 | motorized Mini25 manipulator unit with display SM-5 |
Patch-clamp amplifier | npi electronic GmbH, Tamm, Germany | SEC-05LX npi | |
Digitizer | National Instruments | BNC-2090 | |
Data acquisition software WinWCP | John Dempster, University of Scotland, Glasgow, UK | http://spider.science.strath. ac.uk/sipbs/ software.htm | |
Visual stimulus generator QDS | Thomas Euler, University of Tübingen, Germany | has to be operated on a separate computer controlling 2 monitors (user interface, stimulus monitor) | |
Neutral density filters | ITOS, Mainz, Germany |