Her beskriver vi en fremgangsmåde til direkte at visualisere microregional vævshypoxi i mus cortex<em> In vivo</em>. Det er baseret på samtidig to-foton-billeddannelse af nicotinamid-adenin-dinucleotid (NADH) og corticale mikrocirkulation. Denne fremgangsmåde er nyttig til høj opløsning analyse af væv oxygentilførsel.
Hjernens evne til at fungere ved høje niveauer af metabolisk behov afhænger kontinuerlig oxygentilførsel ved blodgennemstrømning og væv oxygendiffusion. Her præsenterer vi en visualiseret eksperimenterende og metodisk protokollen til direkte at visualisere microregional vævshypoxi og at udlede perivaskulære ilt gradienter i musen cortex. Det er baseret på den ikke-lineære forhold mellem nicotinamid-adenin-dinucleotid (NADH) endogene fluorescensintensitet og oxygenpartialtryk i det væv, hvor observeret væv NADH fluorescens brat stiger på væv iltindholdet under 10 mmHg 1. Vi bruger to-foton excitation ved 740 nm, hvilket giver mulighed for samtidig excitation af iboende NADH væv fluorescens og blodplasma i kontrast til Texas-Red dextran. Fordelene ved denne fremgangsmåde i forhold til eksisterende fremgangsmåder omfatter følgende: den udnytter en iboende væv signal og kan udføres ved anvendelse af standard to-foton in vivo imaldrende udstyr, det giver mulighed for kontinuerlig overvågning i hele synsfeltet med en dybde opløsning på ~ 50 um. Vi viser, at hjernevæv områder længst væk fra cerebrale blodkar svarer til sårbare skelsættende områder, som er den første til at blive funktionelt hypoxisk efter et fald i vaskulær iltforsyning. Denne metode giver en til billede microregional cortical iltning og er derfor anvendelig til at undersøge rollen af utilstrækkelig eller begrænset væv iltforsyning i neurovaskulære sygdomme og slagtilfælde.
Høj rumlig opløsning information om oxygendiffusion er vigtigt at forstå, hvordan blodgennemstrømning i hjernen reguleres for at tilvejebringe oxygen til hjerneceller, og opfylde metaboliske behov. Traditionelle polarografiske ilt målinger ved hjælp af Clark-stil glaselektroderne er meget invasive og har lav rumlig opløsning 2-3 og signifikant (anden række) responstid. Hidtil eneste ikke-invasiv metode til måling af pO2 i hjernevæv er phosphorescens quenching, hvor hastigheden af nedbrydning af den exciterede proben er proportional med oxygenkoncentrationen 4. Denne metode giver nøjagtige iltkoncentrationer, men kræver en proprietær farvestof og en teknisk avanceret fosforescens levetid imaging system. Her viser vi en enkel, enklere tilgang, der kan gennemføres på en standard to-foton imaging system med to flurescence kanaler. Vores fremgangsmåde drager fordel af en indre væv signal 5 ennd kræver kun kontrasterende visualisering af cortical mikrocirkulation. Grund af den ikke-lineære, i det væsentlige binær forøgelse af NADH fluorescens ved funktionelt at begrænse oxygenkoncentrationer en øget iboende NADH fluorescens observeres kun i områder med betydeligt, metabolisk begrænsende hypoxi. En vigtig implikation er, at væv grænser iltdiffusion fra corticale mikrokar direkte ses af cylinderformede intensitet ændringer af endogen NADH fluorescens. Vi henviser til disse strukturer, som Krogh cylindre, idet konceptet cylindrisk formede strukturer, der definerer den oxygenerede volumen væv, som omgiver et blodkar blev indført i august Krogh, og er for nylig blevet eksperimentelt observeret ved anvendelse af to-foton NADH billeddannelse 1. Krogh cylindre billeder kan opsamles i 3D ved at tage en z-stak af billedrammer. De er især fremtrædende i nærheden af gennemtrængende arterioler og de er kongruent vidh kapillærrør forarmet periarteriolar væv cylindre 1,4.
At tilvejebringe en objektiv bestemmelse af Krogh vævet cylinderens radius R (se afsnit 5.2) målte vi deres radiale pixelintensitetsniveauerne værdier inden for et veldefineret segment mellem midten af cylinderen og den ydre afgrænsning ved hjælp af Matlab funktionen "improfile". Den ydre grænse af segmentet skal vælges til at strække sig med en sikkerhedsmargen over det synlige grænse. At forbedre signal-støj-niveau vi averageed i alle radiale linier, der er nødvendige for at dække det synlige cylindersegmentet ved 1 ° trin. Den resulterende gennemsnitlige radiale intensitet profil inden for segmentet viste en kraftig stigning, der svarede til den synlige vævet grænsen R. Det, vi passer en S-formet funktion (f.eks Boltzmann-funktion) til gennemsnitlige radiale intensitet profil og brugt sit vendepunkt (også kendt som x 0) som en definition af R. De tilsvarende to-photon microangiography (Texas-rød) viste tværsnit af en enkelt central blodkar i centrum af cylinderen. Diameteren af den centrale blodkar kan anvendes direkte til at bestemme r.
To-foton NADH billeddannelse tilvejebringer den samme rumlige opløsning som samtidig høj opløsning billeddannelse af den korticale microangiography. Et vigtigt træk til kvantitativ anvendelse af denne fremgangsmåde er, at p 50 NADH fluorescens stigningen er blevet målt til at være 3,4 ± 0,6 mm Hg 1, og at NADH fluorescensintensiteten som en funktion af microregional væv pO2 kan matematisk beskrevet med en sigmoidal funktion. . Vi viser, at denne teknik tillader en at identificere områder i hjernen, der er mest sårbare over for hypoksi (ved at reducere oxygenindholdet i luften til 10%). Vi viser også, at iltdiffusion følger en simpel geometrisk perivaskulær mønster.
Et crittisk trin til denne fremgangsmåde, er kvaliteten af den kraniale vinduet præparat. Operationen må frembringe minimal skade for ikke at forstyrre blodstrømmen til det blotlagte område. En bekymring er, at i et kirurgisk kompromitteret præparat, kan cortex under vinduet være hypoxisk til at begynde med, udelukker enhver meningsfuld eksperimenter. En velforberedt kraniel vindue skal have intakte store og små blodkar med levende blodgennemstrømningen i alle skibstyper, og ingen væsentlig blødning langs kanterne. Under normoxiske forhold (PaO2 80-100 mmHg, Sp O2 97-99%) i hjerneparenkymet skal udvise en ensartet, homogen NADH fluorescens uden iøjnefaldende, lyse væv pletter med forhøjet NADH fluorescens.
En fundamental fysisk begrænsning i vores tilgang er begrænset dybde penetration. Den blågrønne NADH fluorescens i hjernen hurtigt dæmpes hæmoglobin absorption og væv lysspredning ved disse bølgelængder. Selv med høj numerisk apertur (f.eks 1,05) vandnedsænkning mål to-foton NADH imaging er i øjeblikket begrænset til cortical lag I og II. Denne begrænsning er fagligt relevant, fordi energiomsætningen i eller i nærheden af hvid substans sandsynligvis vil afvige fra grå stof. Imidlertid vil undersøgelse af dybe corticale strukturer, såsom lag IV-VI eller subkortikale strukturer såsom hvide substans skrifter eller striatum kræve anvendelse af specialiserede mikrolinser som beskrevet i musen cortex in vivo 6.
NADH-baserede målinger af oxygendiffusion grænser kan være særligt nyttigt, når den kombineres med andre målinger, såsom analyser af funktionelle hyperæmi, og detektion af kapillære fluxhastigheder 7. For eksempel kan denne teknik være indrettet til at visualisere hypoxi ved slagtilfælde og Alzheimers sygdom (AD)-modeller. Den simple geometri oxygendiffusion gør det muligt at forudsige oxygen gradient i mikrovaskulære senge under omstændigheder, hvor kapillær densitet er deøget 8 (f.eks AD 9), og at undersøge, om hjernevæv regioner med nedsat kapillær tæthed er i øget risiko for iltmangel skader som følge af microstrokes. Evnen til at afbilde microregionally også gør det muligt at undersøge geometri og størrelse væv microstrokes og bestemme mængden af væv, hvori hypoxi forekommer, såvel som forholdet mellem vævshypoxi og efterfølgende neuronal død eller kapillær remodellering 10.
Endelig, da stigninger i endogen NADH fluorescens er en direkte følge af akut mitokondriel dysfunktion, denne metode giver mulighed for at bruge NADH billeddannelse som en specifik reporter for neurale energistofskiftet 11 og en proxy for mitokondriel dysfunktion.
Som konklusion er to-foton-billeddannelse af endogent NADH fluorescens et simpelt, krævende værktøj, som kan anvendes til at forstå ilttilførsel og forbrug i hjernen under både normaleog i patologiske tilstande.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Maiken Nedergaard (University of Rochester Medical Center) for hovedet pladen design. Arbejdet har været støttet af NIH priser til SD (R01DA026325 og P30AI078498 og fondsmidler til KK (DANA fundament Brain and Immunoimaging program, American Heart Association 0635595T og ALS Association [# 1112)]).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Heating pads | Beyond Bodi Heat | ||
Ophthalmic ointment (Artificial tears) | Pfizer | ||
Povidone-iodine 10% solution | Betadine | ||
Ferric chloride 10% solution | |||
Cement | Stoelting Company | 51456 | |
Cyanoacrylate 454 | Loctite | ||
aCSF | Harvard Apparatus | 597316 | |
Microtorque II handpiece kit | Pearson | R14-0002 | |
IRF 007 drill bits | Fine Science Tools | 19008-07 | |
Forceps #5 | Fine Science Tools | 11295 | |
Forceps #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
#0 glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 63750-01 | |
Photomultiplier tube | Hamamatsu | HC125-02 | |
Ti:Sapphire laser Mai-Tai | Spectra-Physics |