Hier beschreiben wir eine Methode, um direkt zu visualisieren mikroregionale Gewebehypoxie in der Maus Kortex<em> In-vivo-</em>. Es wird auf gleichzeitigen Zwei-Photonen-Bildgebung von Nicotinamidadenindinucleotid (NADH) und der kortikalen Mikrozirkulation bezogen. Diese Methode eignet sich für hochauflösende Analyse von Gewebe-Sauerstoffversorgung.
Die Fähigkeit des Gehirns, um auf einem hohen Niveau der metabolischen Funktion abhängig von der Nachfrage kontinuierliche Sauerstoffversorgung durch den Blutfluss und Gewebe Sauerstoffdiffusion. Hier präsentieren wir eine visualisierte experimentellen und methodischen Protokoll direkt sichtbar mikroregionale Gewebehypoxie und perivaskuläre Sauerstoff Gradienten in der Maus Cortex abzuleiten. Es ist auf dem nicht-lineare Beziehung zwischen Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH) endogenen Fluoreszenzintensität und Sauerstoff-Partialdruck in dem Gewebe, wo das Gewebe NADH-Fluoreszenz abrupt am Gewebe Sauerstoff unter 10 mmHg 1 beobachtet bezogen. Wir verwenden zwei-Photonen-Anregung bei 740 nm, die für die gleichzeitige Anregung der intrinsischen Fluoreszenz NADH Gewebe und Blutplasma mit Texas-Red Dextran gegenübergestellt werden können. Die Vorteile dieses Verfahrens gegenüber bestehenden Ansätzen gehören die folgenden: es nutzt eine intrinsische Gewebe Signal und kann mit Standard-Zwei-Photonen in vivo im werdenAltern wird gebraucht und es erlaubt eine kontinuierliche Überwachung im gesamten Sichtfeld mit einer Tiefenauflösung von ~ 50 um. Wir zeigen, dass Hirngewebe Bereichen am weitesten von zerebralen Blutgefäße gefährdete Gebiete, die Wasserscheide der Erste, der sich funktionell hypoxischen nach einem Rückgang in der vaskulären Sauerstoffversorgung sind entsprechen. Diese Methode erlaubt es, Bild mikroregionale kortikaler Oxygenierung und ist daher nützlich für die Überprüfung der Rolle der Unangemessenheit oder des eingeschränkten Sauerstoffversorgung im Gewebe neurovaskulären Erkrankungen und Schlaganfall.
Eine hohe räumliche Auflösung Informationen über Sauerstoffdiffusion ist wichtig zu verstehen, wie Blutfluss im Gehirn reguliert wird, um Sauerstoff zu Gehirnzellen zu gewährleisten und metabolischen Bedarf zu decken. Traditionelle polarographischen Sauerstoff-Messungen mit Clark-Stil Glaselektroden sind sehr invasiv und haben eine geringe räumliche Auflösung und 3.2 signifikant (zweite Reihe) Reaktionszeit. Bisher ist die einzige nicht-invasive Methode zur Messung von pO 2 im Hirngewebe ist Phosphoreszenz Abschrecken, wo die Rate der Zerfall des angeregten Sonde ist proportional zur Sauerstoffkonzentration 4. Diese Methode liefert genaue Sauerstoffkonzentrationen, erfordert aber eine proprietäre Farbstoff und ein technisch ausgereiftes Phosphoreszenz Lifetime-Imaging-System. Hier zeigen wir ein übersichtlicher und einfacher Ansatz, der auf einem Standard-Zwei-Photonen-Imaging-System mit zwei flurescence Kanäle geleitet werden kann. Unser Ansatz nutzt eine intrinsische Gewebe ein Signal 5ND benötigt nur kontrastierende Darstellung der kortikalen Mikrozirkulation. Aufgrund der nicht-linearen, im wesentlichen binären Zunahme der Fluoreszenz bei NADH funktional Sauerstoffgrenzkonzentrationen 1, erhöhte intrinsische NADH Fluoreszenz nur in Bereichen mit hohem, metabolisch begrenzen Hypoxie beobachtet. Eine wichtige Folgerung ist, dass Gewebe Grenzen der Sauerstoffdiffusion aus kortikalen Mikrogefäße direkt von zylindrisch geformten Intensität Veränderungen der endogenen NADH Fluoreszenz zu beobachten. Wir bezeichnen diese Strukturen als Krogh Zylinder, weil der Begriff der zylindrisch geformte Strukturen, die das Volumen des oxygenierten umgebende Gewebe ein Blutgefäß durch definieren August Krogh eingeführt wurde, und wurde kürzlich experimentell beobachteten mit Zwei-Photonen-Imaging-NADH ein. Krogh Zylindern Bilder können in 3D, indem sie eine Z-Stapel von Bildrahmen gesammelt werden. Sie sind besonders deutlich in der Nähe des durchdringenden Arteriolen und sie sind nämlich kongruenth Kapillare erschöpft periarteriolären Gewebszylinder 1,4.
Um eine objektive Bestimmung des Krogh Gewebe Zylinder Radius R (siehe Abschnitt 5.2) messen wir ihre radiale Pixelintensitätswerte innerhalb eines klar definierten Segment zwischen der Mitte des Zylinders und der äußeren Grenze mit dem Matlab-Funktion "improfile" bieten. Der äußere Rand des Segments sollte so gewählt werden mit einem Sicherheitsabstand über die sichtbare Grenze verlängert werden kann. Um das Signal-Rausch-Ebene zu verbessern averageed wir über alle radialen Linien benötigt, um den sichtbaren Zylinder Segment bei 1 °-Schritten zu decken. Die daraus resultierende mittlere radiale Intensitätsprofil innerhalb des Segments wiesen einen starken Anstieg, der auf den sichtbaren Gewebe-Grenze R entsprach. Die passten wir noch eine sigmoide Funktion (zB Boltzmann-Funktion) mit dem gemittelten radialen Intensitätsverlauf und nutzte seine Wendepunkt (auch als x 0 genannt) als eine Definition von R. Die entsprechenden zwei-pHoton Mikroangiographie (Texas-Rot) zeigte den Querschnitt eines einsamen zentrale Blutgefäß in der Mitte des Zylinders. Der Durchmesser des zentralen Blutgefäß direkt angewendet werden, um r zu bestimmen.
Zwei-Photonen-Imaging-NADH bietet die gleiche räumliche Auflösung als die gleichzeitige hochauflösende Bildgebung der kortikalen Mikroangiographie. Ein wichtiges Merkmal für die quantitative Anwendung dieses Verfahrens ist, daß p 50 des NADH Fluoreszenzanstieg wurde gemessen, um von 3,4 sein ± 0,6 mm Hg 1 und dass die NADH-Fluoreszenzintensität als eine Funktion der mikroregionale Gewebe pO 2 kann mathematisch beschrieben werden eine sigmoidale Funktion. . Wir zeigen, dass diese Technik, um Brain Bereichen, die besonders anfällig für Hypoxie (durch Verringern Sauerstoffgehalt in der Luft um 10%) zu identifizieren. Wir zeigen auch, dass Sauerstoffdiffusion eine einfache geometrische perivaskuläre Muster folgt.
Ein critschen Schritt dieses Verfahrens ist die Qualität des Schädelfenster Herstellung. Die Operation sollte nur geringe Schäden, um nicht den Blutfluss in den exponierten Bereich stören. Eine Sorge ist, dass in einer chirurgisch kompromittiert Vorbereitung, die Rinde unter dem Fenster kann hypoxischen zunächst unter Ausschluss irgendwelcher aussagekräftige Experimente. Ein gut vorbereiteter kranialen Fenster sollte intakt Dur-und Moll Blutgefäße mit lebendigen Blutfluss in allen Schiffstypen und ohne signifikante Blutungen entlang der Kanten auf. Unter normoxischen Bedingungen (PaO2 80-100 mmHg, Sp. 97-99% O2) das Hirnparenchym sollten einheitliche, homogene NADH Fluoreszenz ohne auffällige, helle Gewebe Patches mit erhöhten NADH Fluoreszenz zeigen.
Eine grundlegende physikalische Beschränkung unseres Ansatzes ist Eindringtiefe begrenzt. Die blau-grüne NADH Fluoreszenz im Gehirn ist schnell gedämpft durch Hämoglobin-Absorption und Streuung Gewebe bei diesen Wellenlängen. Selbst mit hoher numerischer Apertur (z. B. 1,05) WasserImmersionsobjektive Zwei-Photonen-Imaging-NADH ist derzeit auf kortikalen Schichten I und II beschränkt. Diese Einschränkung ist wissenschaftlich relevant, weil Energiestoffwechsel in oder in der Nähe der weißen Substanz wird wahrscheinlich von grauen Substanz unterscheiden. Jedoch würde die Untersuchung der tiefen kortikalen Strukturen wie Schichten IV-VI oder subkortikalen Strukturen wie weißen Substanz oder im Striatum erfordern die Verwendung von spezialisierten Mikrolinsen wie bei der Maus in vivo Cortex 6 beschrieben.
NADH-basierte Messung der Sauerstoffdiffusion Grenzen kann besonders nützlich sein, wenn sie mit anderen Messungen, wie Analysen der funktionellen Hyperämie, und den Nachweis von Kapillare Fluxraten 7 zusammengefasst. Zum Beispiel kann diese Technik geeignet ist, Hypoxie Schlaganfall und Alzheimer-Krankheit (AD)-Modelle zu visualisieren. Die einfache Geometrie der Sauerstoffdiffusion ermöglicht es, die Sauerstoff-Gradienten in mikrovaskulären Betten unter Umständen, wo Kapillardichte ist de vorherzusagenerhöhte 8 (z. B. AD 9) und zu prüfen, ob Hirngewebe Regionen mit reduzierter Kapillardichte ein erhöhtes Risiko für Schäden, die durch Hypoxie Mikrohüben sind. Die Fähigkeit, Bild microregionally ermöglicht es auch, die Geometrie und Größe des Gewebes Mikrohüben prüfen und zu bestimmen das Volumen des Gewebes, in dem Hypoxie auftritt, sowie die Beziehung zwischen Gewebehypoxie und nachfolgenden neuronalen Tod oder Umbau Kapillare 10.
Schließlich, da Erhöhungen der endogenen NADH Fluoreszenz die direkte Folge der akuten mitochondriale Dysfunktion sind, erstellt diese Methode die Möglichkeit, NADH-Bildgebung als eine spezifische Reporter für neuronale Energiestoffwechsel 11 und einen Proxy für mitochondriale Dysfunktion zu verwenden.
Zusammenfassend ist Zwei-Photonen-Imaging von endogenen NADH Fluoreszenz eine einfache, anspruchslose Tool, mit dem Sauerstoffversorgung und-verbrauch im Gehirn sowohl unter normalen verstehen kannund in pathologischen Zuständen.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Dr. Maiken Nedergaard (University of Rochester Medical Center) für den Kopf-Bauweise. Die Arbeit wurde von NIH Auszeichnungen wurden auf SD (R01DA026325 und P30AI078498 und Stiftung Stipendien an KK (Dana Foundation Brain and Immunoimaging Programm, American Heart Association 0635595T und der ALS Association [# 1112)]) unterstützt.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Heating pads | Beyond Bodi Heat | ||
Ophthalmic ointment (Artificial tears) | Pfizer | ||
Povidone-iodine 10% solution | Betadine | ||
Ferric chloride 10% solution | |||
Cement | Stoelting Company | 51456 | |
Cyanoacrylate 454 | Loctite | ||
aCSF | Harvard Apparatus | 597316 | |
Microtorque II handpiece kit | Pearson | R14-0002 | |
IRF 007 drill bits | Fine Science Tools | 19008-07 | |
Forceps #5 | Fine Science Tools | 11295 | |
Forceps #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
#0 glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 63750-01 | |
Photomultiplier tube | Hamamatsu | HC125-02 | |
Ti:Sapphire laser Mai-Tai | Spectra-Physics |