Här beskriver vi en metod att direkt visualisera microregional vävnadshypoxi i mus cortex<em> In vivo</em>. Den är baserad på samtidig två-foton-avbildning av nikotinamidadenindinukleotid (NADH) och den kortikala mikrocirkulationen. Denna metod är användbar för hög upplösning analys av vävnad syretillförsel.
Hjärnans förmåga att fungera vid höga nivåer av metaboliska efterfrågan styrs av kontinuerlig syretillförsel genom blodflödet och vävnad syre diffusion. Här presenterar vi en visualiserad experimentell och metodologiska protokollet direkt visualisera microregional vävnadshypoxi och sluta perivaskulära syre gradienter i musen cortex. Den är baserad på den icke-linjära förhållandet mellan nikotinamidadenindinukleotid (NADH) endogen fluorescensintensitet och syrepartialtryck i vävnaden, där observerades vävnad NADH fluorescens abrupt ökar till nivåer vävnadssyrespänningama under 10 mmHg 1. Vi använder tvåfotonexcitering till 740 nm, vilket möjliggör samtidig excitation av inneboende NADH vävnader fluorescens och blodplasma kontrast med Texas-Red dextran. Fördelarna med denna metod jämfört med befintliga metoder inkluderar följande: det tar fördel av en inneboende vävnad signal och kan utföras med användning av standard två-foton-in vivo-imåldrande utrustning, den tillåter kontinuerlig övervakning i hela synfältet med ett djup upplösning på ~ 50 nm. Vi visar att hjärnvävnad områden längst från cerebrala blodkärl motsvarar känsliga avrinningsområden som är den första att bli funktionellt hypoxisk efter en nedgång i vaskulär syretillförsel. Denna metod gör att man kan bilden microregional kortikal syresättning och är därför användbart för att undersöka rollen av otillräcklig eller begränsade vävnad syretillförsel i neurovaskulära sjukdomar och stroke.
Hög spatial upplösning information om syrediffusion är viktigt att förstå hur blodflödet i hjärnan regleras för att tillhandahålla syre till hjärnceller, och för att möta det metaboliska behovet. Traditionella polarografiska syre mätningar med hjälp av Clark-stil glas elektroder är mycket invasiva och har låg rumslig upplösning 2-3 och signifikant (andra området) svarstid. Hittills den enda icke-invasiv metod för att mäta pO 2 i hjärnans vävnad är fosforescens kylning, där graden av förfall den exciterade sonden är proportionell mot syrekoncentrationen 4. Denna metod ger noggranna syrehalter, men kräver en egen färg och en tekniskt sofistikerad fosforescens livslängd bildsystem. Här visar vi en enkel, enklare tillvägagångssätt som kan utföras på en standard två-foton-avbildningssystem med två flurescence kanaler. Vår strategi drar nytta av en inneboende vävnad signal 5 ennd kräver endast kontrasterande visualisering av den kortikala mikrocirkulationen. På grund av den icke-linjära, väsentligen binära ökning av NADH fluorescens vid funktionellt att begränsa syrehalter 1 ökade inneboende NADH fluorescens observeras endast i områden med betydande metaboliskt begränsa hypoxi. En viktig implikation är att vävnad gränser syre diffusion från kortikala mikrokärl direkt observera cylindriskt formade intensitet förändringar av endogen NADH fluorescens. Vi hänvisar till dessa strukturer som Krogh cylindrar, eftersom begreppet cylindriskt formade strukturer som definierar syresatta volymen av vävnaden som omger ett blodkärl introducerades av August Krogh och har nyligen experimentellt observerats med hjälp av två-photon NADH avbildning 1. Krogh cylindrar bilder kan samlas i 3D genom att ta ett z-bunt med bildrutor. De är särskilt framträdande i närheten av penetrerande arterioler och de är kongruent with kapillär utarmade periarteriolära vävnad cylindrar 1,4.
Att ge en objektiv bestämning av Krogh vävnaden cylindern radie R (se avsnitt 5,2) mätte vi deras radiella pixelintensitetsvärden inom en väldefinierad segmentet mellan centrum av cylindern och den yttre gränsen med hjälp av Matlab-funktionen "improfile". Den yttre gränsen av det segment bör väljas för att sträcka sig med en säkerhetsmarginal bortom synlig gräns. För att förbättra signal-brus-nivå vi averageed över alla radiella linjer behövs för att täcka den synliga cylindern segmentet vid 1 ° steg. Den resulterande genomsnittliga radiell intensitet profil inom segmentet uppvisade en kraftig ökning som motsvarade den synliga vävnaden gränsen R. Det vi passar en sigmoidal funktion (t.ex. Boltzmann funktion) för att den genomsnittliga radiell intensitet profil och använde sin brytpunkt (även känd som x 0) som en definition av R. Motsvarande två-photon microangiography (Texas-rött) avslöjade tvärsnitt av en ensam central blodkärl i centrum av cylindern. Diametern hos den centrala blodkärlet kan direkt tillämpas för att bestämma r.
Två-foton NADH avbildning ger samma rumsliga upplösning som samtidigt högupplösta avbildning av den kortikala microangiography. Ett viktigt särdrag för den kvantitativa tillämpning av denna metod är att p 50 av NADH fluorescensökning har uppmätts till att vara av 3,4 ± 0,6 mm Hg 1 och att den NADH fluorescensintensiteten som en funktion av microregional vävnad pOa 2 kan matematiskt beskrivas med en sigmoidal funktion. . Vi visar att denna teknik tillåter en att identifiera områden i hjärnan som är mest utsatta för hypoxi (genom att minska syrehalten i luften till 10%). Vi visar också att syre diffusion följer en enkel geometrisk perivaskulära mönster.
En kritical steg för denna metod är kvaliteten hos den kraniala fönstret beredningen. Operationen bör ge minimal skada för att inte störa blodflödet till det utsatta området. Ett problem är att i ett kirurgiskt äventyras beredning kan cortex under fönstret är hypoxisk att börja med, vilket utesluter några meningsfulla experiment. En väl förberedd kraniell fönster bör ha intakta större och mindre blodkärl med levande blodflödet i alla typer av fartyg och ingen signifikant blödning längs kanterna. Under normoxiska förhållanden (PaO2 80-100 mmHg, Sp O2 97-99%) i hjärnparenkymet bör uppvisa en enhetlig, homogen NADH fluorescens utan iögonfallande, ljusa vävnad fläckar med förhöjd NADH fluorescens.
En grundläggande fysisk begränsning av vår strategi är begränsat djup penetration. Den blå-gröna NADH fluorescens i hjärnan snabbt dämpas av hemoglobin absorption och vävnaden spridning vid dessa våglängder. Även med hög numerisk apertur (t.ex. 1,05) vattennedsänkning mål två-photon NADH avbildning är för närvarande begränsad till kortikal lager I och II. Denna begränsning är vetenskapligt relevant eftersom energiomsättningen i eller i närheten av vit substans kommer sannolikt skiljer sig från grå. Skulle dock undersökningen av djupa kortikala strukturer såsom lager IV-VI eller subkortikala strukturer såsom vita substans skrifter eller striatum kräver användning av specialiserade mikrolinser som beskrivs i musen cortex in vivo 6.
NADH-baserad mätning av gränser syrediffusion kan vara särskilt användbar när den kombineras med andra mätningar såsom analys av funktionell hyperemi, och detektion av kapillära omloppshastigheter 7. Till exempel kan denna teknik vara anpassad för att visualisera hypoxi i stroke och Alzheimers sjukdom (AD) modeller. Den enkla geometrin av syre diffusion gör att man kan förutse syret gradienten i mikrovaskulära sängar under sådana omständigheter där kapillärtäthet är deökade 8 (t.ex. AD 9) och att undersöka om hjärnvävnad regioner med nedsatt kapillär densitet är en ökad risk för hypoxi skador på grund av microstrokes. Förmågan att bilden microregionally också tillåter en att undersöka geometri och storlek för vävnad microstrokes och bestämma volymen av vävnad i vilken hypoxi uppträder, liksom förhållandet mellan vävnadshypoxi och efterföljande neuronal död eller kapillär remodellering 10.
Slutligen, eftersom ökningar i endogent NADH fluorescens är en direkt följd av akut mitokondriell dysfunktion skapar denna metod möjlighet att använda NADH avbildning som en specifik reporter för neural energiomsättning 11 och en proxy för mitokondriell dysfunktion.
Sammanfattningsvis är två-foton avbildning av endogen NADH fluorescens ett enkelt, kravlös verktyg som kan användas för att förstå syretillförsel och konsumtion i hjärnan både under normalaoch patologiska tillstånd.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr Maiken Nedergaard (University of Rochester Medical Center) för huvudet plåten design. Arbetet har stötts av NIH utmärkelser till SD (R01DA026325 och P30AI078498 och stiftelsens bidrag till KK (DANA stiftelsen Hjärna och Immunoimaging program, American Heart Association 0635595T och ALS Association [# 1112)]).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Heating pads | Beyond Bodi Heat | ||
Ophthalmic ointment (Artificial tears) | Pfizer | ||
Povidone-iodine 10% solution | Betadine | ||
Ferric chloride 10% solution | |||
Cement | Stoelting Company | 51456 | |
Cyanoacrylate 454 | Loctite | ||
aCSF | Harvard Apparatus | 597316 | |
Microtorque II handpiece kit | Pearson | R14-0002 | |
IRF 007 drill bits | Fine Science Tools | 19008-07 | |
Forceps #5 | Fine Science Tools | 11295 | |
Forceps #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
#0 glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 63750-01 | |
Photomultiplier tube | Hamamatsu | HC125-02 | |
Ti:Sapphire laser Mai-Tai | Spectra-Physics |