Her beskriver vi en metode for å direkte visualisere microregional vevshypoksi i mus cortex<em> In vivo</em>. Den er basert på samtidige to-foton avbildning av nikotinamid adenindinukleotid (NADH) og kortikale mikrosirkulasjonen. Denne metoden er nyttig for høy oppløsning analyse av vev oksygentilførsel.
Hjernens evne til å fungere ved høye nivåer av metabolsk etterspørsel avhenger kontinuerlig oksygentilførsel gjennom blodstrøm og vev oksygen diffusjon. Her presenterer vi en visualisert eksperimentell og metodisk protokoll til direkte visualisere microregional vevshypoksi og å antyde perivaskulær oksygen gradienter i musen cortex. Den er basert på ikke-lineært forhold mellom nikotinamid adenindinukleotid (NADH) endogen fluorescensintensiteten og oksygen partialtrykk i vevet, hvor observert vev NADH fluorescens brått øker på vev oksygennivået under 10 mmHg en. Vi bruker to-foton eksitasjon ved 740 nm som gjør det mulig for samtidig eksitasjon av egenverdi NADH vev fluorescens og blodplasma kontrastert med Texas-Rød dekstran. Fordelene med denne metoden fremfor eksisterende tilnærminger omfatter følgende: det tar fordel av en indre vev signal og kan utføres ved hjelp av standard to-foton in vivo imaldrende utstyr, det tillater kontinuerlig overvåking i hele synsfeltet med en dybde oppløsning på ~ 50 mikrometer. Vi viser at hjernevev områder lengst fra cerebrale blodkar tilsvare sårbare vannskille områder som er de første til å bli funksjonelt hypoksisk etter en nedgang i vaskulær oksygentilførsel. Denne metoden gjør det mulig å bilde microregional kortikal oksygenering og er derfor nyttig for å undersøke rollen utilstrekkelig eller begrenset vev oksygentilførsel i nevrovaskulære sykdommer og slag.
Høy romlig oppløsning informasjon om oksygen diffusjon er viktig å forstå hvordan blodgjennomstrømningen i hjernen er regulert til å gi oksygen til hjerneceller, og for å møte metabolsk etterspørselen. Tradisjonelle polarographic oksygen målinger ved hjelp av Clark-stil glass elektrodene er svært invasiv og har lav romlig oppløsning 2-3 og signifikant (andre rekke) responstid. Så langt den eneste ikke-invasiv metode for måling av PO 2 i hjernevev er morilden slukke, der frekvensen av forfallet av den opphissede sonden er proporsjonal med oksygenkonsentrasjonen 4. Denne metoden gir nøyaktige oksygenkonsentrasjoner, men krever en proprietær fargestoff og en teknisk sofistikert morilden levetid imaging system. Her viser vi en grei, enklere tilnærming som kan gjennomføres på en standard to-foton imaging system med to flurescence kanaler. Vår tilnærming tar fordel av en indre vev signal 5 ennd krever bare kontrast visualisering av kortikale mikrosirkulasjonen. På grunn av den ikke-lineære, i hovedsak binær økning av NADH fluorescens ved funksjonelt begrense oksygenkonsentrasjoner en økt egenverdi NADH fluorescens er kun observert i områder med betydelig, metabolsk begrensende hypoksi. En viktig implikasjon er at vevet grensene for oksygen diffusjon fra kortikale microvessels er direkte observerbart av cylindrically formet intensitet endringer av endogen NADH fluorescens. Vi viser til disse strukturene som Krogh sylindere, fordi begrepet cylindrically formede strukturer som definerer oxygenated volumet av vevet rundt en blodåre ble introdusert i august Krogh og har nylig blitt eksperimentelt observert ved hjelp av to-foton NADH bildebehandling en. Krogh sylindere bilder kan hentes i 3D ved å ta en z-stabel med bilde rammer. De er spesielt fremtredende i nærheten av gjennomtrengende arterioler og de er congruous viddh Kapillær utarmet periarteriolar vev sylindere 1,4.
Å gi en objektiv fastsettelse av Krogh vev sylinderen radius R (se pkt. 5.2) vi målte deres radial pikselintensiteten verdier innenfor et veldefinert segment mellom midten av sylinderen og ytre grense ved hjelp av Matlab funksjonen "improfile". Den ytre grensen av segmentet bør velges for å utvide med en sikkerhetsmargin utover synlig grense. For å forbedre signal-til-støy nivå vi averageed over alle radiale linjer som trengs for å dekke synlige sylinder segmentet på 1 ° skritt. Den resulterende gjennomsnittlig radial intensitet profil innenfor segmentet viste en bratt økning som tilsvarer den synlige vev grensen R. Det vi passer en sigmoidal funksjon (f.eks Boltzmann funksjon) til den gjennomsnittlige radial intensitet profil og brukte sin vendepunkt (også kjent som x 0) som en definisjon av R. Den tilsvarende to-photon microangiography (Texas-rød) avslørte tverrsnitt av en enslig sentral blodåre i sentrum av sylinderen. Diameteren på den sentrale blod fartøyet kan bli brukt direkte for å bestemme r.
To-foton NADH bildebehandling gir samme romlige oppløsning som samtidige høy oppløsning avbildning av kortikale microangiography. En viktig funksjon for kvantitativ anvendelsen av denne metoden er at p 50 av NADH fluorescens økningen er målt til å være på 3,4 ± 0,6 mm Hg 1 og at NADH fluorescensintensiteten som en funksjon av microregional vev PO 2 kan matematisk beskrives med en sigmoidal funksjon. . Vi viser at denne teknikken gjør det mulig å identifisere hjernen områder som er mest sårbare for hypoksi (ved å redusere oksygeninnholdet i luften til 10%). Vi viser også at oksygen diffusjon følger en enkel geometrisk perivaskulær mønster.
En critiCal skritt for denne metoden er kvaliteten av den kraniale vinduet forberedelse. Operasjonen skal produsere minimal skade for ikke å forstyrre blodtilførselen til det utsatte området. En bekymring er at i en kirurgisk kompromittert forberedelse, kan cortex under vinduet være hypoksisk til å begynne med, utelukker enhver meningsfull eksperimenter. En godt forberedt kranial vindu skal ha intakte store og små blodkar med levende blodgjennomstrømning i alle skipstyper og ingen signifikant blødning langs kantene. Under normoksisk forhold (PaO2 80-100 mmHg, Sp O2 97-99%) i hjernen parenchyma skal fremvise uniform, ensartet NADH fluorescens uten synlige, lyse vev patcher med forhøyet NADH fluorescens.
En grunnleggende fysisk begrensning av vår tilnærming er begrenset dybde penetrasjon. Den blå-grønne NADH fluorescens i hjernen er raskt dempes med hemoglobin absorpsjon og vev spredning ved disse bølgelengdene. Selv med høy numerisk apertur (f.eks 1.05) vannnedsenking mål to-foton NADH avbildning er foreløpig begrenset til kortikal lag I og II. Denne begrensningen er vitenskapelig relevant fordi energiomsetningen i eller i nærhet til hvit substans vil trolig variere fra grå materie. Vil imidlertid etterforskningen av dype kortikale strukturer som for eksempel lag IV-VI eller subkortikale strukturer som hvit substans traktater eller striatum krever bruk av spesialiserte mikrolinser som beskrevet i mus cortex in vivo 6.
NADH-basert måling av oksygen diffusjon grenser kan være spesielt nyttig når den kombineres med andre målinger som analyser av funksjonell hyperemi, og påvisning av kapillære flux priser 7. For eksempel kan denne teknikken tilpasses visualisere hypoksi i slag og Alzheimers sykdom (AD) modeller. Den enkle geometrien av oksygen diffusjon gjør det mulig å forutsi oksygen gradient i mikrovaskulære senger under omstendigheter der kapillær tetthet er deøkt 8 (f.eks AD 9) og for å undersøke om hjernevev regioner med redusert kapillær tetthet har økt risiko for hypoksi skader som skyldes microstrokes. Muligheten til bildet microregionally også gjør det mulig å undersøke geometri og størrelse av vev microstrokes og bestemme omfanget av vev som hypoksi oppstår, samt forholdet mellom vevshypoksi og påfølgende neuronal død eller kapillær remodeling 10.
Til slutt, siden økninger i endogen NADH fluorescens er en direkte følge av akutt mitokondriell dysfunksjon, skaper denne metoden anledning til å bruke NADH bildebehandling som en spesifikk reporter for nevrale energiomsetningen 11 og en proxy for mitokondriell dysfunksjon.
I konklusjonen, er to-foton avbildning av endogen NADH fluorescens et enkelt, lite krevende verktøy som kan brukes til å forstå oksygen levering og forbruk i hjernen under både normaleog i patologiske tilstander.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Maiken Nedergaard (University of Rochester Medical Center) for hodet plate design. Arbeidet har vært støttet av NIH utmerkelser til SD (R01DA026325 og P30AI078498 og fundament tilskudd til KK (DANA fundament Brain og Immunoimaging program, American Heart Association 0635595T og ALS Association [# 1112)]).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Heating pads | Beyond Bodi Heat | ||
Ophthalmic ointment (Artificial tears) | Pfizer | ||
Povidone-iodine 10% solution | Betadine | ||
Ferric chloride 10% solution | |||
Cement | Stoelting Company | 51456 | |
Cyanoacrylate 454 | Loctite | ||
aCSF | Harvard Apparatus | 597316 | |
Microtorque II handpiece kit | Pearson | R14-0002 | |
IRF 007 drill bits | Fine Science Tools | 19008-07 | |
Forceps #5 | Fine Science Tools | 11295 | |
Forceps #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
#0 glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 63750-01 | |
Photomultiplier tube | Hamamatsu | HC125-02 | |
Ti:Sapphire laser Mai-Tai | Spectra-Physics |