1. Prøvefremstilling Plantematerialer høstes og straks nedfrosset. Frosne plantematerialer er pulverformige af blanderen mølle (eller mørtel) og lagres i Falcon-rør eller Eppendorf-rør ved -80 ° C. 2. Ekstraktion for metabolit Profiling Portion frosset plantemateriale i en 2 ml Eppendorf-rør. Tilsættes 5 ul ekstraktionsbuffer milligram af frisk vægt af frosset plantemateriale. Tilsættes et metal (eller gilconia) kuglen og homogeniseres frosne pulver med blanderen Mill i 2 minutter ved 25 ls-1. Centrifugeres 10 minutter ved 12.000 rpm. Supernatanten overføres til NANOSEP centrifugalfilterenhed. Centrifuger i 2 minutter ved 4000 rpm. Supernatanten overføres til nyt Eppendorf-rør og opbevares ved -20 ° C indtil anvendelse. 3. Metabolit Profilering ved LC-MS Nedsat HPLC og kontrollere temperaturen af søjlen ovnen og prøvebakken. Opsæt MS tilstand og kontrollere dennes aktuelle status af vakuum og varme kapillær. Udfør m / z kalibrering af MS-detektor. Overførsel af 50 ul ekstrakt til hætteglas til LC-MS. Indsprøjtes 5 ul af ekstrakter til LC-MS. 4. Dataanalyse Konfigurer Xcalibur eller Metalign 4, og vælg den dataanalyse, der skal behandles. Forbered en tabel over fundne toppe af din interesse i overensstemmelse med sammensatte klasse i tabel I. Identificer toppe ved co-eluering af standard forbindelser. Anmærk opdaget toppe bruger MS 2 analyse, litteraturoversigt, metabolit databasesøgning (figur 2, 12,13). 5. Forudsigelse af metabolismepathway'en Konstruer en mulig vej med fundne forbindelser. Forudsigelse af vejen ved hjælp af peak annotationer bør være baseret på den kemiske struktur af detekterede stofs ved at forudsige forbinder enzymatiske funktioner på metaboliseringsvej 13. Strukturering biosyntetiske trin bør gennemføres med præcis peak annotation. Men bestemmelse af nøjagtig kemisk struktur, f.eks sukkerdelen er ikke uundværlige i dette trin, fordi forudsigelse af sukkerdelen og adducerede position er meget vanskeligt at identificere med MS-analyse. Bestemmelse af sukker-type som hexoside og pentoside vil blive identificeret ved enzymatisk analyse af sukker donor på det sidste trin af projektet. Meste konstruere forudsigelse af pathway bør udføres så lille molekyle er mellemprodukt med større molekyle med undtagelse af de visse tilfælde, såsom dehydratiseringsreaktion. Listen af atomart molekylvægt, for eksempel 16 m / z for forskel-H og-OH-del (oxidation), 14 m / z (carbonatom) for forskellen mellem-OH og-OMe (methylering) og 162 m / z ( MW-H2O) for hexose (glycosylering), er nyttig til forudsigelse. Bestemmelse afændring type med korrelationsanalysen af væv specificiteter hjælper forudsigelse af metaboliseringsvej. Database over generelle metaboliseringsvejen såsom KEGG database ( http://www.genome.jp/kegg/ ) og PlantCyc ( http://plantcyc.org/~~V ), er meget effektiv til forudsigelse af metaboliseringsvej for din interesse. 6. Fremstillinq af Gene liste med Arabidopsis ortologe Gene ID Hent gen ID-listen fra genomisk database. Tilføj Arabidopsis gen ID ortologe gen, i tilfælde af dit mål anlæg er ikke Arabidopsis. Forbered en liste over gener i jeres vej-af-interesse. Annotation af Arabidopsis pathway data og genfamiliemedlemmer data er tilgængelige i tair hjemmeside ( http://www.arabidopsis.org/~~V ). Hvis du udarbejdet en liste over Arabidopsis ortologe gener, kan du efterfølgende kombinationne dem. 7. Co-udtrykt gen analyse Test det klargjorte genet ID-liste for at søge den bedste database til din vej ved at kontrollere sammenhængen med kendte genpar i din vej-af-interesse (Tabel II). Hvis co-ekspression database eller genekspression databasen ikke er tilgængelige i anlæg din interesse, skal Arabidopsis co-ekspression database bruges sammen med en liste over Arabidopsis ortologe gener. I tilfælde af byg, ris, poppel, hvede, Medicago og sojabønne, co-ekspression analyse af plantearter anvendes (tabel II). Konstruer rammerne for din målgruppe co-ekspression netværk baseret på forbindelserne af de kendte gener i jeres vej-af-interesse. Tilføj korrelerede kandidatgener (r <0,4 ~ 0,90, inden tilnærmet værdi af koefficienten værdi mellem forbindelserne af de kendte gener i jeres vej-af-interesse) og kontrollere deres gen anmærkning i din PRedicted familier til tilslutninger af dette netværk for at finde de bedste kandidatgener (figur 3). Threshold af koefficient værdi bør koordineres i overensstemmelse med nettets struktur og tæthed af korrelerede gener. Lav liste over de gener, som du er i stand til at indsnævre som værende specialiseret til dit mål vej. Check genekspression af orgel særlige forhold og stress reaktioner af dine kandidatgener. 8. Integration af alle information til at forudsige nye veje Tilsættes velkarakteriserede gener, der er anvendt til søgning af co-ekspression analyse forudsagde metabolisk pathway. Se ukarakteriserede dele i denne vej, for eksempel ukarakteriseret enzymatiske trin, transport proteiner og transkriptionsfaktorer. Forudsige mest egnet gen anmærkning af disse manglende ukarakteriserede trin. Kombiner resultater af metabolit profilering og kandidatgener af in silico gene ekspression baseret på den forudsagte bane. Arrangere kandidatgener for den forudsagte pathway ifølge genfunktion, for eksempel acetyltransferase for acetylerede metabolit, glycosyltransferase for glycosid, P450 for oxideret forbindelse. Fylogenetisk træ analyse af aminosyresekvenserne er nyttigt til nogle brede genfamilien såsom P450 og glycosyltransferase. Kontroller konsekvens af vævs-forhold eller stress reaktioner mellem metabolit ophobning og genekspression niveau af kandidatgener. Kontrollér forbindelserne til andre stofskifte for at give substrat og stress responsive gener. 9. Eksperimenter til Gene identifikation ved hjælp af Bio-ressourcer Kontroller tilgængeligheden af bioressourcer for lettelse af eksperiment for kandidat gen identifikation. Udfør et eksperiment for identifikation af gen-funktion ved hjælp af bio-ressourcer, såsom KO mutantbibliotek og fuld-længde cDNA bibliotek. Than eksperimenter til funktionel identifikation af gener med fremstilling af overekspression planter og knockout mutanter enzymatisk assay og promotoren bindingsassay skal udføres for de bedste kandidatgener i din forudsigelse. Rekombinant protein assay for karakterisering af protein egenskaber og fremstilling af overekspression planter bedre skal udføres efter bekræftelse af metabolit profil med KO-mutant, da det tager betydeligt længere tid at fremstille rekombinant protein, og genkloning til transformation. 10. Repræsentative resultater Proceduren for integreret analyse er beskrevet i denne protokol har mange muligheder afhængig angivne eksperimenterende formål og valg af biologiske og analytiske kombinationer. Valg af procedurer og eksperimentel design bør udføres korrekt på grundlag af dit mål vej, forbindelser og plantearter. Integrationsstrategien er beskrevet i denne protokol er FOC bruges på annotation af plante genfunktion og opdagelsen af nye gen funktioner med en effektiv udnyttelse af flere bio-og data-ressource. Forventet udfald er lovet at give med det eneste tilfælde af afgørende forudsigelse. Dette faktum indikerer, at hvis der er nok beviser ikke kan gives ved kombination profiler, bør eksperimentere ikke startes. Af denne grund, i alle tilfælde kan yderligere indledende eksperimenter såsom målrettet genekspressionsprofilering ved RT-PCR, understøtter din forudsigelse af gen-funktion. Nøjagtigheden og korrektheden af forudsigelser korrelerer højere afhængig af kvalitativ forskel og antallet af variation af kombination. Desuden kan gode kandidater og gyldige resultater kun komme fra præcis forudsigelse af veje. Peak annotation bør gennemføres af en kombination af flere forskellige måder, for eksempel litteratur-undersøgelse, der henvises planteekstrakt, MS n analyse, orgel specificitet og mutant analyse 13. 1 "src =" / files/ftp_upload/3487/3487fig1.jpg "/> Figur 1. Oversigt over den eksperimentelle strømmen af genet kommentar via kombinerede metode. I nogle tilfælde, starte projekter med opdagelsen af et nyt højdepunkt, der påvises hos særlige betingelser eller væv, og ønsket om at forstå sin rolle inden for sit stofskifte. I andre tilfælde formål projektet er genidentifikation eller opdagelsen af vigtige regulatoriske faktorer såsom transkriptionsfaktorer. Udformningen af forsøget bør høvlet med en datasæt, der viser tydelige forskelle af metabolit niveauer i target pathway ved anvendelse af en bred vifte af vævsprøver fra forskellige organer, og for differentielt dyrkede planter eller planter udsat for stress-tilstande, og at udsætte materialet for metabolit profilering. Mutante og transgene planter såvel som QTL husning avl materiale udgør også egnet genetisk materiale til disse undersøgelser. Forudsigelse af nye vej skal udføres omhyggeligt med nøjagtigpeak annotation og kombination tilgang med forskellige typer metabolotype såsom orgel værdipapirer og stress reaktioner i henhold til genekspression data på din vej-af-interesse. I det sidste trin, bør metabolit og transkript profilering udføres som i sidste ende vil, når de kombineres med in silico analyse af web-midler og in vitro karakterisering af genekspression via heterolog ekspression fører til bekræftelse af genet kandidaten og belysning af dens funktion og position i et metabolisk pathway. Forkortelser: QTL og kvantitativ egenskab loci. Figur 2. Arbejde strøm af kombinatorisk fremgangsmåde til top noter. En procedure til top identifikation og noter af standarden forbindelsen, sammenlignet med vildtype-og slå mutanter, multi-dimensional massespektrometri af målet top henvisning til massespektre ren compounds fra databaser 12. Forkortelser: DB, database, KO, knock-out, 1-D, en-dimensionelle, 2-D, to-dimensionelle NMR, kernemagnetisk resonans, IR, infrarød, MS n, masse-masse spectrometries. Figur 3. Eksempel samregulering netværk analyse af anthocyanin-vejen. Coekspression analyser blev udført ved anvendelse af Prime ( http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index ) baseret på datasættet ATTEDII version 3 8,2 med Pajek program ( http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/ ). Positive korrelationer (r <0,5) anvendes til at netværksforbindelser. Rød node: tolv anthocyanin enzymatiske gener (At5g13930 og CHS, TT4 og chalcon-synthase, At3g55120, CHI, TT5, chalcon isomerisere, At3g51240, F3H, TT6, flavanon-3-hydroxylase, At5g07990, F3'H, TT7, flavonoid-3'-hydroxylase, At5g17050, Fd3GT, UGT78D2, flavonoid-3 – O-glucosyltransferase, At5g17220, AtGSTF12, TT19 ; At5g42800, DFR, TT3, dihydroflavonol reduktase, At4g22880, ANS / LDOX, TT18, anthocyanidin Synthese, At4g14090, A5GT, anthocyanin 5 – O-glucosyltransferase, At5g54060, A3G2 "XT, formodede anthocyanin 3 – O-glucosid 2" – O – xylosyltransferasen, At3g29590, A5GMaT, anthocyanin 5 – O-glucosid 6'' '- O-malonyltransferase, At1g03940, A3GCouT, anthocyanin 3 – O-glucosid 6 "- O – P-coumaroyltransferase) og to transkriptionsfaktorer til anthocyanin produktion (At1g56650, PAP1, At1g66390, PAP2) blev anvendt til at søge kandidatgener kandidatgener blev fundet af en "skæringspunktet mellem sæt" søgning med en tærskelværdi med en koefficient på r <./ Em >> 0,50 spørgsmålstegn ved skæringspunktet mellem sæt af alle forespurgte gener (fjorten anthocyanin biosyntesegener). En co-ekspression netværk, herunder korrelerede kandidatgener (68 gener) og spurgte gener (14 gener), blev re-konstrueret af en "sammenkobling af sæt" Søg med r> 0,50 ved hjælp af PRIME-databasen. De output filer, der blev formateret med en '. Net' fil fra PRIME databasen og netværk blev udarbejdet ved hjælp af Pajek software. Blå knudepunkt angiver kandidatgener som korrelerede med anthocyanin gener. arter Major sekundær metabolit Arabidopsis thaliana Glucosinolater, flavonol, anthocyanin, sinapoyl afledte Populus trichocarpa Flavonol, anthocyanin, salicylat derivat Vitis vinifera Flavonol, anthocyanin, tannin, stilbene Solanum lycopersicum Flavonol, anthocyanin, glycoalkaloid, chrologenate relaterede, Nicotiana tabacum Flavonol, anthocyanin, nicotianamide, chrologenate relaterede, acylsugar Oryza sativa Glycoflavone, anthocyanin, sterolderivater Zea maj Glycoflavone, anthocyanin, benzoxazinon, sterolderivater Medicago truncatula Isoflavon, anthocyanin, saponin, Lotus japonica Isoflavon, flavonol, anthocyanin, saponin, Tabel I. Større sekundære metabolitter i model plantearter. Co-udtryk database Adresse Plant kryds specerne COP http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/~~V PlaNet http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/ Plantearter ATEED-II http://atted.jp/ BAR http://142.150.214.117/welcome.htm COP http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop GeneCAT http://genecat.mpg.de/ Arabidopsis ACT http://www.arabidopsis.leeds.ac.uk/act/coexpanalyser AthCoR@CSB.DB http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcor/ath.html CressExpress http://cressexpress.org/~~V PRIME http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index Oryza sativa RiceArrayNet http://arraynet.mju.ac.kr/arraynet/~~V Rice Array Database http://www.ricearray.org/coexpression/coexpression.shtml Tabel II. Fås genekspression database for in silico co-ekspression analyse.