Опробование киназы Деятельность LRRK2 В пробирке</em

Summary

Лейцин Богатые киназы Повторите 2 является большой киназы многодоменных, мутации в которых наиболее распространенных генетических причин болезни Паркинсона. Анализ активности киназы этого белка оказалась важнейшим инструментом в понимании биологии и дисфункции этого белка. В данной работе<em> В пробирке</em> Опробование киназы деятельности LRRK2 и выбор его мутантов описывается, обеспечивая экспериментальная система для изучения фосфорилирования предполагаемых субстратов и потенциальных дисфункции LRRK2 в болезнь.

Abstract

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain¹. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson’s disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state^2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities^4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations^7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool^9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson’s is open to debate.

A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads^4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK2¹². Recently, Daniëls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available¹³. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate – dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin – have all been used, as have a series of putative physiological substrates including α-synuclein, Moesin and 4-EBP^14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Protocol

Безопасность Протокол, описанный ниже, используется АТФ, меченных радиоактивными 32 P в позицию γ фосфат следовать киназы деятельности LRRK2. Она основана на стандартных протоколов, используемых в нашей лаборатории, и поэтому в отношении многих из шагов в этом процессе такие как бег гели, западной промокательной и т.д. материалов и точные условия должны быть приняты в качестве руководства в качестве оборудования и протоколов используемые для этих процессов зависит от лаборатории к лаборатории. Соединения, содержащие изотопы, которые испускают ионизирующее излучение, потенциально вредных для здоровья человека и строгого лицензирования и правил на институциональном и национальном уровне контролировать их использование. Эксперименты в этом протоколе были проведены следующие обучение в открытое использование источника излучения в Университетском колледже Лондона и после надлежащей лабораторной практики указаниями безопасности услуг в колледже (руководства лавинilable на http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/glp_hurs.pdf ). Использование открытых источников излучения не должно быть предпринято до соответствующей подготовки и утверждения регулирующими органами. Регулирующий орган ответственный за открытое источника излучения в научно-исследовательской лаборатории варьируется от страны к стране. Примерами этого являются: в Великобритании, здравоохранения и безопасности ( http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm ), в США Комиссия по ядерному регулированию ( http:// www.nrc.gov / материалы / MIAU / Новых-гидов-comm.html ), в Канаде, канадская Комиссия по ядерной безопасности ( http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ), а в Германии Das Bundesamt für Strahlenschutz ( HTTP : / / www.bfs.de / де / BFS ). Пользователи в других странах, должны подтвердить местные нормы, правила и лицензирующих органов с их офицер радиационной безопасности. Меры безопасности, имеющие отношение к этому протоколу были отмечены в тексте, выделены радиоактивные символ трилистника ( ). 1. Подготовка киназы реакция Все реакционные смеси, подготовленный в 1,5 мл трубы образца с винтовыми колпачками, содержащих уплотнительное кольцо для предотвращения распространения радиоактивности. Оттепель белка на льду – LRRK2 дикого типа, D1994A, G2019S. составляют реакция на льду – 10 нм LRRK2, 0.5μg/μl MBP, 5ul 10х буфера киназы, доливают до 50 мкл с водой. 2. Запуск анализа Все шаги, используя 32 P СПС, следует взять ркружева в специально отведенных зонах излучения. Подходящие средства индивидуальной защиты должны носить – под стандартной операционной процедурой в нашей лаборатории, к ним относятся лабораторный халат, двойные перчатки и защитные очки. Образцы, содержащие 32 P АТФ должны быть защищены от пользователей, 6мм экранах Perspex сведения к минимуму воздействия. В случае необходимости, индивидуальные средства для мониторинга должны быть использованы – в UCL, любой сертифицированной открытой пользователем источник излучения должен иметь фильма значок для контроля радиационного облучения в ходе экспериментов. Все экспериментальные поверхности должны быть оценены на предмет радиоактивного загрязнения до и после использования использованием Гейгер счетчика. Все потенциально загрязненных расходных материалов должны быть утилизированы в строгом соответствии с руководящими принципами институциональной для захоронения радиоактивных отходов. Перед началом теста, набор блоков для отопления 30 ° C и 100 ° С соответственно Удалить 32 P ATP от -20 морозильник (заметим, что условия хранения сюда 32 P СПС может варьироваться в зависимости от поставщика или тип radionucleotides используется). сканирования за пределами контейнера перед использованием, оттепель за экраном плексиглас. При реакции на льду, добавить 1 мкл 32 Р АТФ каждому наряду с 10 мкм холодной АТФ. Хорошо перемешайте с пипеткой. Импульсный центрифуги довести жидкость до нижней части трубки, сводя к минимуму риск заражения. Удалить 15μl аликвоту для нулевой момент времениг прекращает реакцию в аликвоту добавлением 5 мкл 4х образец SDS буфера и денатурации при 100 ° С в течение 10 минут. Импульсный центрифуги довести жидкость до нижней части трубки, сводя к минимуму риск заражения. Оставшиеся образец, помещенный в нагревательный блок и инкубировали при 30 ° С в течение 60 минут. 15μl удален на 60 минуте точку времени и реакция прекращается добавлением 5 мкл 4х образец SDS буфера и денатурации при 100 ° С в течение 10 минут. Импульсный центрифуги довести жидкость до нижней части трубки, сводя к минимуму риск заражения. 3. Иммуноблоттинг образцов и анализ результатов Образцы работать на SDS-PAGE 10 и 4-12% Bis-трис polyacrilamide геля, приготовленного для электрофореза использованием MOPS работает буфера. 20 мкл каждого образца загружены на гель вместе с 7μl острыхTain белка стандартные лестницы. Гель работает на 160В в течение 90 минут, или пока красителя перед достиг конца геля. Все жидкости в контакте с радиоизотопы должны рассматриваться как радиоактивные отходы и утилизировать в соответствии с ведомственным руководящим принципам. UCL правила диктуют, что жидкие радиоактивные отходы должны быть отброшены льется назначенный радиоактивных раковины распоряжении с обильной водой. Белки передаются на мембрану PVDF через пятно западной. Передача буфера подготовлены, 1x Трис глицин плюс 20% метанола. PVDF мембранные и фильтровальной бумаги вырезать до правильного размера для геля и активированный с ледниковыми метанола в случае мембранной или предварительно мокрые от перевода буфера в случае фильтровальную бумагу. Мембрана должна быть предварительно помечен чернилами шариковой чтобы позволить идентификацию ориентации. Гель удален из пластКорпус микросхемы и избыток акриламида удалить и утилизировать как радиоактивные отходы. Гель должен быть сформирован в бутерброд с мембраной и фильтровальную бумагу, чтобы не было пузырей существуют между мембраной и гель, а затем, расположенных в западной аппарата пятно с мембраной между гелем и анодом. Передача осуществляется на 25В в течение 16 часов. После белка-переносчика к PVDF, мембрана должна быть сушат при комнатной температуре. Наконец, сухой мембраны должны быть изолированы между листами ацетата целлюлозы и подвергают либо люминесцентном экране или рентгеновской пленки, чтобы обнаружить меченого белка. Выдержка может работать от нескольких часов до более чем неделю в зависимости от удельной активности радиоизотопного используются и фермент кинетики реакции. Phosphoscreen отсканированных / пленка обрабатывается. При использовании экрана фосфор, изображения должны быть сохранены в высоком разрешении TIFF или растровый файл, если используется пленка то результирующая переходыsparency должны быть отсканированы с помощью настольного сканера и сохранены в высоком разрешении TIFF или растровый файл. Образ может быть проанализирована в ImageJ, бесплатная программа доступна на Национальных Институтов Здоровья веб-сайт ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ). 4. Представитель Результаты На рисунке 1 показаны репрезентативные результаты для анализа осуществляется с помощью дикого типа, G2019S и D1994A LRRK2 с основному белку миелина как общий субстрат акцептора фосфата. Аутофосфорилирование LRRK2 виден ≈ 200kDa, с несколькими полосами представляющих фосфорилированных MBP видно 20-40kDa. Обратите внимание на отсутствие в аутофосфорилирование D1994A (киназы мертвых) полосу, и повышение фосфорилирования из-за мутации G2019S. Отметим также, остаточная фосфорилирование MBP в киназы мертвой полосе. Это может быть из-за неполной аблации киназы деятельности LRRK2 по D1994A мутант или отражать присутствие ое следов загрязнения киназ в реакции. Рисунок 1.

Discussion

Эта статья описывает основные протокол для опробования киназы деятельности LRRK2 использования в системе пробирке. В интересах краткости, это была ограничена один час конечная точка шаблона с помощью универсального субстрата, но общий протокол применяется к кругу потенциальных субстратов и поддаются более сложный анализ изучения кинетики активности киназы LRRK2 . Это подчеркивает одно из ключевых преимуществ использования системы в пробирке для изучения поведения киназы белка, такие как это: потому что есть полный контроль над концентрации фермента и субстрата, можно генерировать кинетических данных и рассчитать К _м и _макс значения для реакции. Для получения более подробной кинетической оценки или оценки воздействия предполагаемого ингибиторы, более высокая пропускная способность системы (например, той, которая обеспечивается использованием LRRKtide подложку, которую можно получить Invitrogen) является превосходным alternatiве с подходом, описанным здесь.

Важно, однако, признать, что система редукционистской модели, предоставляемой в анализах пробирке киназы является лишь одним из инструментов для изучения биологии киназы и его отношения с потенциальными субстратов. Данные анализов, таких как это должно быть использован в сочетании с другими подходами, чтобы получить полную картину того, как ведет себя киназы в пробирке и в сотовой связи. Например, предполагаемый субстрат фосфорилированных в пробирке могут быть проанализированы масс-спектрометрии для выявления возможных phosphosites, которые затем можно манипулировать направленного мутагенеза (например,. Превращение серина или треонина акцептор фосфата остатки никому-phosphorylatable отходы, такие как аланин) для изучения функционального Последствия фосфорилирования естественных отл.

Ключевым моментом в интерпретации данных в пробирке анализ системы, такие как это вероятность eitheГ типа я или типа II (ложный положительный или ложно отрицательные) ошибок. Редукционистской характер этой системы, к сожалению располагает его к обеим – в случае с бывшей, с очищенной предполагаемый субстрат и очищенный киназы в искусственно непосредственной близости и в высокой концентрации (по сравнению с сотовой среды) может привести к артефактного событий фосфорилирования. И наоборот, многие киназы функционируют как часть комплекса в контексте клетки, и требуют кофакторами для фосфорилирования данного субстрата, чтобы произойти. Как отмечалось выше, положительный результат от фосфорилирования предполагаемого подложку с использованием в системе анализа пробирке должна быть протестирована в системе сотовой для проверки результата, а отрицательный результат следует интерпретировать с осторожностью.

В свете этого, очень важно, где можно иметь как положительные, так и отрицательные элементы управления для сравнительного исследования активности киназы ваш интерес. Тщательный отбор положительных противоречивыел, которая известна активность по отношению к вашей белок, наряду с отрицательным контролем, который вряд ли фосфорилировать ваш предполагаемый субстрат, имеют большую ценность. Один из кандидатов управления LRRK2 является Рецептор взаимодействует киназы 3, которая тесно связана с первичной последовательности киназы области LRRK2 но очень разные общей доменной структуры ^18. Эта функция доступна в качестве рекомбинантного белка из Invitrogen и используется в качестве стандартного элемента управления в нашей лаборатории.

Следует также отметить, что коммерчески доступные формы LRRK2 не хватает N-конец белка и помечается глутатион-S-трансферазы, и это должно приниматься во внимание как потенциальных вмешивающихся факторов при проведении анализов киназы с этим белком, как это не известно, какую роль N-терминал LRRK2 могут играть в нормальной функции этого белка. Если, например, N-концевой части LRRK2, которая отсутствует в белке, используемые в настоящем протоколеимеет решающее значение для вербовки специфическим субстратом для киназы области LRRK2 то это будет иметь большое влияние на наблюдаемые фосфорилирование сказал субстрата в пробирке в системе, описанной выше.

Даже с этими оговорками, однако, значение, которое придается биологии LRRK2 в исследования Паркинсона подчеркивает полезность этого протокола, как ценный инструмент для изучения поведения этого белка в пробирке в определении.

Materials

Reagent	Company	Catalogue Number	Comment
LRRK2 wild type	Invitrogen	PV4873
LRRK2 G2019S	Invitrogen	PV4881
LRRK2 D1994A	Invitrogen	PV6051
Kinase buffer	Cell Signalling	9802S
MBP	Sigma	M1891
32P g ATP	Perkin Elmer	BLU002X500UC	500µCi, 30Ci /mMole
4x LDS sample buffer	Invitrogen	NP0007
2-Mercaptoethanol	Sigma	M6250
Protein standards	Invitrogen	LC5800
MOPS running buffer	Invitrogen	NP0001
Bis-tris acrylamide gel	Invitrogen	NP0321	4-12% 1mm 10well
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010
Transfer buffer	Invitrogen	NP0006

Table 1. Reagents

Distilled and de-ionized water was used for all dilution steps

Equipment type	Company	Comment
Geiger counter	Mini Instruments
SDS PAGE tank	Invitrogen
Transfer tank	Invitrogen
Heat blocks (2)	Eppendorf
Phosphor screen	GE	X-ray film can be substituted
Phosphor imager	GE
Exposure cassette	GE
Centrifuge	Eppendorf
Perspex shielding
1.5ml tubes	VWR	Screw top with O ring

Table 2. Equipment