류신 리치 반복 키나제 2 큰 multidomain의 키나제이며, 돌연변이가있는 파킨슨병의 가장 흔한 유전적 원인이됩니다. 이 단백질 키나제의 활동 분석은이 단백질의 생물학과 장애를 이해하는 중요한 도구로 입증되었습니다. 본 논문에서는<em> 체외에서</em> LRRK2의 키나제 활동의 시금 및 돌연변이의 선택은 putative 기판과 질병에 LRRK2의 잠재적인 장애의 인산화를 조사하는 실험 시스템을 제공 설명되어 있습니다.
류신 리치 반복 키나제 2 (LRRK2)는 GTPase 도메인 (단지 단백질의 RAS를 위해, ROC를 칭했다)과 키나제 도메인을 하나 포함하여 복잡 multidomain 구조를 보유하고 단백질의 ROCO 제품군의 2527 아미노산 회원입니다. 파킨슨병 (PD)를 일으킬 LRRK2의 돌연변이 2004 년 발견은 정상적인 기능에 연구의 거대한 볼륨의 초점이되고 LRRK2 결과와 단백질이 질병 상태 2,3에서 틀려서 어떻게되는지. LRRK2의 기능에 초기 조사는 효소 활동을 4-6에 주력. 명확한 사진으로 인해 돌연변이 이러한 일관성의 변경의 등장은 아직 있지만, 그룹의 숫자 데이터가 변이 7,8에 연결된 세포 죽음을 LRRK2의 키나제 활동의 중요성을 강조했다. 최근 출판물은 핵심 실험 도구 9-11를 제공 LRRK2의 키나제 활동을 대상으로 억제제를보고있다. 이러한 데이터의 불빛에,그들은 파킨슨병에 대한 잠재적인 약물 표적 여부를 논의하기 위해 열린 있지만 LRRK2의 효소 속성이 단백질의 생물로 우리에게 중요한 창문을 살 가능성이 높습니다.
다른 방식의 숫자는 분석 LRRK2의 키나제 활동을하는 데 사용되었습니다. 처음 assays는 포유 동물 세포 라인에 overexpressed 에피토프 태그 단백질을 사용하여 수행되었으며 assays는 아가로 오스 비즈 4,5,7에 고정이 단백질을 사용하여 실시와 함께, immunoprecipitated. 이후, 솔루션에 LRRK2의 재조합 조각을 정화하는 것은 또한 LRRK2 12 2527에 잔류물 970를 포함한 곤충 세포에서 정화 GST 태그 조각은 예를 들어, 사용되었습니다. 최근 다니엘스 외가. 인간의 배아 신장 세포에서 솔루션에 전체 길이 LRRK2의 고립을보고, 그러나이 단백질은 13 널리 사용할 수 없습니다. 반면, GST 융합은 LRRK2의 양식 상업 availabl는 잘립니다E (Invitrogen에서 자세한 내용은 표 1 참조)하고 LRRK2 키나제 활동에 대한 분석을 보여주는 편리한 도구를 제공합니다. LRRK2 키나제 활동에 대한 몇 가지 출력이보고되었습니다. Moesin에서 트레오닌 558의 인산화에 따라 불리는 LRRKtide – – LRRK2 자체 인공 기판의 일반적인 키나제 기판 및 인산화 등 Myelin 기본 단백질 (MBP)의 인산화의 Autophosphorylation 모두 사용되었습니다 등 putative 생리 기판의 일련을 가지고 α – synuclein, Moesin 및 4 ebp를 14-17을 포함합니다. LRRK2을위한 기판 이러한 단백질의 상태가 불분명 남아 있으며, 아래에 설명된 같은 프로토콜이 잠재적인 기판의 범위에 대한 감독 분석 LRRK2 키나제 활동이 시스템의 유틸리티를 지적, 일반적인 기판으로 MBP를 사용하여 초점을 맞출 것이다대로.
본 논문은 체외 시스템을 사용하여 LRRK2의 키나제 활동을 시금위한 기본 프로토콜을 설명합니다. 짧음의 관심에서, 이것은 일반적인 기판을 사용하여 한 시간 동안 엔드 포인트 템플릿 제한하지만, 일반적인 프로토콜은 잠재적인 기판의 다양한 적용과 LRRK2의 키나제 활동의 속도론을 조사보다 정교한 분석 의무가 있습니다되었습니다 . 이것은이 같은 단백질 키나제의 행동을 조사하기 위해 체외 시스템을 사용하여의 주요 장점 중 하나를 강조 : 효소와 기판의 농도를 완벽하게 제어가 있기 때문에, 그것은 운동 데이터를 생성하고 K m을 계산 할 수 있습니다 반응 및 V 최대 값. 자세한 운동 평가 또는 putative 억제제의 영향을 평가, 높은 처리량 시스템은 (예 : Invitrogen에서 사용할 수있는 LRRKtide 기판을 사용하여 여유되는 등) 뛰어난 alternati입니다여기에서 설명한 접근했습니다.
그것은 중요하지만, 체외의 키나제의 assays에 의해 제공 reductionist 모델 시스템이 인식하는 하나의 도구는 키나제 및 잠재적인 기판과의 관계의 생물학을 검사합니다. 이와 같은 assays에서 데이터는 키나제는 체외에서 세포 맥락에서 작동하는 방법의 포괄적인 그림을 얻기 위해 다른 접근법과 함께 사용해야합니다. 예를 들어, 체외에서 phosphorylated putative 기판은 다음 기능을 검사를 타겟으로 돌연변이 유발 (예. 변환할 세린이나 알라닌과 같은 없음 – phosphorylatable 잔류물에 트레오닌 인산염 수용체의 잔류물)로 조정할 수있어 가능한 phosphosites를 식별하는 질량 분석계로 분석 가능 인산화의 전의 생체내의 결과.
이와 같은의 시험 관내 분석 시스템에서 데이터를 해석에서 중요한 고려 eithe 가능성있다R 타입 I 또는 유형 II (거짓 양성 또는 거짓 부정적인) 오류. 이 시스템의 reductionist의 자연 안타깝게도 모두 그것을 disposes – 전직의 경우 (휴대폰 환경에 비해) 정화 putative 기판을 앓고 있고 인위적으로 가까이에있는 높은 농도에서 키나제를 정화하는 것은 artefactual 인산화 이벤트를 발생할 수 있습니다. 반대로, 많은 kinases는 세포의 컨텍스트 내에서 복합의 일환으로 기능하고, 발생할 주어진 기판의 인산화 공동 요소를 필요로합니다. 위에서 명시한대로, putative 기판의 인산화에서 긍정적인 결과가 시험 관내 분석 시스템을 사용하여 그 다음 결과를 확인하기 위해 셀룰러 시스템에서 테스트해야하고, 부정적인 결과를주의해서 해석해야합니다.
이걸로 미루어 보아, 그것은 관심의 키나제의 활동의 비교 연구를 허용하는 긍정과 부정 모두 컨트롤이 가능합니다 어디에 중요합니다. 긍정적인 contro주의 선택귀하의 putative 기판 phosphorylate하지 않을 수 있습니다 부정적인 컨트롤과 함께 관심의 단백질을 향해 알려진 활동이 난 매우 중요합니다. LRRK2 하나의 후보 제어 LRRK2의 키나제 도메인에 밀접하게 관련 기본 순서를 가지고 있지만 매우 다른 전체 도메인 구조 18가 키나제 3, 상호 작용 수용체이다. 이것은 Invitrogen에서 재조합 단백질로 사용할 수 있으며 저희 연구실에 표준 컨트롤로 사용됩니다.
이것은, LRRK2의 상용 양식이 단백질의 N – 말단이 부족하고 글루타티온 – S – transferase이 단백질과 키나제 assays을 수행하면 이것은 잠재적인 혼란함을 주죠 요소로 고려되어야 태그가 있는지 또한 지적해야 그것이 알려진이 아니므로 LRRK2의 N – 터미널이 단백질의 정상적인 기능에서 어떤 역할을 수 있습니다. 예를 들어, 단백질에 결석 LRRK2의 N – 터미널 부분은이 프로토콜에 사용되는 경우,그러면이의 관찰 인산화에 큰 영향을 미칠 것입니다 LRRK2의 키나제 도메인에 특정 기판의 채용에 중요 체외 시스템에의 기판 위에서 설명한했다.
도 이러한 경고와 함께, 그러나 파킨슨병의 연구에 LRRK2의 생물에 부착된의 중요성은 체외 설정에서이 단백질의 동작을 조사하는 귀중한 도구로이 프로토콜의 유틸리티를 강조 표시합니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 파킨슨병의 영국 리서치 연구원 (부여 F1002)입니다. 이 작품은 그의 회원 신경과의 UCL 연구소, 셰필드 대학과 MRC 단백질 인산화 단위에서에서 온 영국 파킨슨병 컨소시엄에 Neurodegeneration 수상의 Wellcome 신뢰 / MRC 공동 통화 (WT089698) (UKPDC)에 의해 부분적으로 지원되었다 던디 대학.
Reagent | Company | Catalogue Number | Comment |
LRRK2 wild type | Invitrogen | PV4873 | |
LRRK2 G2019S | Invitrogen | PV4881 | |
LRRK2 D1994A | Invitrogen | PV6051 | |
Kinase buffer | Cell Signalling | 9802S | |
MBP | Sigma | M1891 | |
32P g ATP | Perkin Elmer | BLU002X500UC | 500µCi, 30Ci /mMole |
4x LDS sample buffer | Invitrogen | NP0007 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
Protein standards | Invitrogen | LC5800 | |
MOPS running buffer | Invitrogen | NP0001 | |
Bis-tris acrylamide gel | Invitrogen | NP0321 | 4-12% 1mm 10well |
PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
Transfer buffer | Invitrogen | NP0006 |
Table 1. Reagents
Distilled and de-ionized water was used for all dilution steps
Equipment type | Company | Comment |
Geiger counter | Mini Instruments | |
SDS PAGE tank | Invitrogen | |
Transfer tank | Invitrogen | |
Heat blocks (2) | Eppendorf | |
Phosphor screen | GE | X-ray film can be substituted |
Phosphor imager | GE | |
Exposure cassette | GE | |
Centrifuge | Eppendorf | |
Perspex shielding | ||
1.5ml tubes | VWR | Screw top with O ring |
Table 2. Equipment