Isolatie en zuivering van kinesine uit Drosophila Embryo's
Summary
Dit is een protocol om actief volle lengte Kinesine isoleren van<em> Drosophila</em> Embryo's voor single-molecule biofysische studies. We laten zien hoe om embryo's te verzamelen, maken het embryo lysaat, en dan polymeriseren microtubuli (MT). Kinesine wordt gezuiverd door immobiliseren van het op de MTS, te stoppen met draaien de kinesine-MT complexen, en dan het vrijgeven van de kinesine van het MT via ATP toevoeging.
Abstract
Motor eiwitten bewegen ladingen langs microtubuli, en vervoeren ze naar specifieke sub-cellulaire locaties. Omdat de gewijzigde vervoer wordt voorgesteld om een verscheidenheid van neurodegeneratieve ziekten ten grondslag liggen, het begrijpen van microtubuli gebaseerd gemotoriseerd transport en de verordening zal waarschijnlijk uiteindelijk leiden tot een betere therapeutische benaderingen. Kinesine-1 is een eukaryote motor eiwit dat beweegt in een anterograde (plus-end) richting langs microtubuli (MT), aangedreven door ATP hydrolyse. Hier hebben we verslag een gedetailleerde zuivering protocol om actief volle lengte kinesine isoleren van Drosophila embryo's, waardoor de combinatie van Drosophila genetica met single-molecule biofysische studies. Te beginnen met ongeveer 50 kopjes leggen, met ongeveer 1000 vrouwen per kopje, voerden we 's nachts collecties. Dit leverde ongeveer 10 ml verpakte embryo's. De embryo's werden bleekmiddel dechorionated (hetgeen ongeveer 9 gram embryo) en gehomogeniseerd. After verstoring is het homogenaat verduidelijkt met een lage snelheid rotatie gevolgd door een snelle centrifugeren. De geklaarde supernatant werd behandeld met GTP en taxol aan de MT polymeriseren. Kinesine geïmmobiliseerd op gepolymeriseerde MT door de toevoeging ATP analoge 5'-adenylaat imidodiphosphate bij kamertemperatuur. Na kinesine bindend, werden microtubuli gesedimenteerd via hoge snelheid centrifugeren door een sucrose kussen. De microtubuli pellet werd vervolgens opnieuw opgeschort, en dit proces werd herhaald. Tot slot is ATP toegevoegd aan de kinesine los te maken van het MT. Hoge snelheid centrifugeren dan afgedraaid de MTS, waardoor de kinesine in het supernatant. Deze kinesine werd onderworpen aan een centrifugaal filter met 100 KD afgesneden filter voor verdere zuivering, in hoeveelheden verdeeld, snap bevroren in vloeibare stikstof en bij -80 ° C. SDS gelelektroforese en Western blotting werd uitgevoerd met het gezuiverde monster. De motorische activiteit van gezuiverde monsters vóór en na de laatste filtratiestap centrifugalewerd geëvalueerd met behulp van een in vitro enkel molecuul microtubule assay. De kinesine fracties vóór en na de centrifugale filtratie heeft processivity zoals eerder in de literatuur. Verdere experimenten worden gedaan om de interactie tussen kinesine en andere transportmiddelen verwante eiwitten te evalueren.
Protocol
Discussion
Bovine hersenen de meest gebruikte uitgangsmateriaal 11 volledige lengte kinesine zuiveren echter murine brein is ook 12 gebruikt. Een groot nadeel van het gebruik van runderen hersenen als een kinesine bron is de beschikbaarheid van verse uitgangsmateriaal: slachthuizen zijn meestal niet toegankelijk, en de hersenen moet zeer vers in om actieve kinesine te verkrijgen. Verder alleen de hersenen van jonge koeien effectief. Tot slot, genetische manipulatie van de koeien is op dit moment geen haalbare…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Met dank aan Kris Ngai en Jason Del Rio voor hun steun en hulp bij dit project. Dit werk werd ondersteund door RO1 subsidie GM070676 naar SPG.
Materials
| Name of the reagent or material | Company | Catalogue number | Comments |
| Agar (Granulated) | Fisher | 1423-500 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous | Fisher | D16-3 | |
| Petri Dishes | Becton | 35 1007 | 60x15mm Style (Polyester) 20/bag |
| Drosophila Culture Vials | UCI | ||
| Tricorn beaker | Econo Lab Inc. | B700-100 | Volume:100ml, size: 58x72mm |
| Yeast | Red Star | 2751 | |
| Nylon Mesh | Genesse Scientific | 57-102 | 120 micron pore size |
| Nylon Mesh | Small Parts | 06-350/35 | |
| Pipes | Sigma | 108321-27-3 | |
| Pipes | Sigma | 108321-27-3 | |
| Glycerol | Fisher | 56-81-5 | |
| EGTA | Sigma | 67-42-5 | |
| MgS04(Anhydrous) | Fisher | 7487-88-9 | |
| PMSF | Sigma | 329-98-6 | |
| Leupeptin | Sigma | 103476-89-7 | |
| Aprotonin | Sigma | 9087-70-1 | |
| TAME | Sigma | 178403-8 | |
| STI | Calbiochem | 65635 | |
| GTP | Sigma | 36051-31-7 | |
| Taxol | Sigma | 33069-62-4 | |
| ATP analog 5′-adenylyl imidodiphosphate | Sigma | 3605-31-7 | |
| NaCl | Mallinckrodt | 7647-14-5 | |
| ATP | Sigma | 74804-12-9 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters: .5 mL, 100kD cut off, 8 pack | Millipore | UFC510008 |
References
- Ashburner, M., Thompson, J. N., Ashburner, M., Wright, T. R. F. The laboratory culture of Drosophila 2A. The genetics and biology of Drosophila. , 1-81 (1978).
- Roberts, D. B. . Drosophila: A Practical Approach. , (1998).
- Kunert, N., Brehm, A. Mass production of Drosophila Embryosand Chromatographic Purification of Native Protein Complexes. Methods in Molecular Biology. 420, 359 (2008).
- Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A., Wilson, L., Matsudaira, P. T., Eds, . Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. 44, (1994).
- Saxton, W. M. Drosophila kinesin: Characterization of microtubule motility and ATPase. Proceedings of the National Academy of Science. 85, 1109 (1988).
- Shubeita, G. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1098 (2008).
- Svoboda, K., Block, S. M. Force and Velocity Measured for Single Kinesin Molecules. Cell. 77, 773 (1994).
- Cole, D. G., Saxton, W. M., Sheehan, K. B., Scholey, J. M. A “Slow” Homotetrameric Kinesin-related Motor Protein Purified from Drosophila embryos. J. Biol. Chem. 269, 22917-22917 (1994).
- Saxton, W. M. Isolation and Analysis of Microtuble Motor Proteins. Drosophila Melanogaster. Bloomington: Academic. 44, 279 (1994).
- Scholey, J. Motility Assay for Motor Proteins. Methods in Cell Biology. 39, 138 (1993).
- Wagner, M. C., Pfister, K., Brody, S., Bloom, G. Purification of kinesin from bovine brain and assay of microtubule-stimulated ATPase activity. Methods in Enzymology. 196, 157 (1991).
- Aizawa, H. Kinesin Family in Murine Nerwous System. The Journal of Cell Biology. 119, 1287-1287 (1992).
- Ori-McKenney, K. M., Xu, J., Gross, S. P., Vallee, R. B. A cytoplasmic dynein tail mutation impairs motor processivity. Nature Cell Biology. 12, 1228-1228 (2010).
