בידוד וטיהור של kinesin מ תסיסנית עוברים
Summary
זהו פרוטוקול לבודד אורך פעיל kinesin מלא<em> תסיסנית</em> עוברים על מולקולה בודדת מחקרים biophysical. אנחנו מראים איך לאסוף עוברי, להפיק את lysate העובר ולאחר מכן לפלמר microtubules (MTS). Kinesin מטוהרים על ידי משתק אותו על MTS, מסתובב כלפי מטה את kinesin-MT מתחמי ולאחר מכן משחררים kinesin מ MTS באמצעות תוספת ATP.
Abstract
חלבונים רכב להעביר מטענים לאורך microtubules, ולהעביר להם תת הסלולר מיקומים ספציפיים. בגלל התחבורה שינה הוא הציע ביסוד מגוון רחב של מחלות ניווניות, הבנה המבוססת microtubule התחבורה המוטורית ורגולציה שלה סביר להניח בסופו של דבר להוביל גישות טיפוליות משופרים. Kinesin-1 הוא חלבון המנוע אוקריוטים הנעה בכיוון האנטרוגרד (בתוספת סוף) יחד microtubules (MTS), מופעל על ידי הידרוליזה של ATP. כאן אנו מדווחים על פרוטוקול מפורט טיהור לבודד אורך פעיל kinesin מלא מעוברים תסיסנית, על מנת לאפשר שילוב של גנטיקה תסיסנית עם מחקרים biophysical מולקולה בודדת. החל עם כ 50 כוסות הנחת, עם כ 1000 נקבות בכל כוס, ביצענו אוספים לילה. זה סיפק כ 10 מ"ל של עוברים ארז. העוברים היו אקונומיקה dechorionated (מניב כ 9 גרם של עוברי), לאחר מכן, ומעורים. AFהפרעה ter, homogenate הובהר באמצעות ספין במהירות נמוכה ולאחריה צנטריפוגה במהירות גבוהה. Supernatant הבהיר טופל GTP ו טקסול כדי לפלמר MTS. Kinesin היה משותק על polymerized MTS על ידי הוספת אנלוגי ATP, 5'-adenylyl imidodiphosphate בטמפרטורת החדר. לאחר kinesin מחייב, microtubules היו משקעים באמצעות צנטריפוגה במהירות גבוהה דרך כרית סוכרוז. גלולה microtubule היה מחדש על תנאי, וזה תהליך חזר על עצמו. לבסוף, ה-ATP נוסף כדי לשחרר את kinesin מ MTS. צנטריפוגה במהירות גבוהה ולאחר מכן סובב את MTS, עוזב את kinesin ב supernatant. זה kinesin היה נתון סינון צנטריפוגלי באמצעות קיצוץ 100 KD את המסנן לטיהור נוסף, aliquoted, הצמד קפואים בחנקן נוזלי, ומאוחסנים ב -80 ° C. SDS אלקטרופורזה בג'ל המערבי סופג בוצעה באמצעות מדגם מטוהרים. פעילות מוטורית של דגימות מטוהרים לפני ואחרי שלב הסינון הסופי צנטריפוגליהוערך תוך שימוש ב assay במבחנה מולקולה בודדת microtubule. את השברים kinesin לפני ואחרי סינון צנטריפוגלי הראה processivity כפי שדווח קודם לכן בספרות. ניסויים נוספים נערכים על מנת להעריך את האינטראקציה בין kinesin וחלבונים תחבורה אחרים בנושא.
Protocol
Discussion
המוח שור הוא חומר המוצא הנפוצה ביותר 11 לטהר באורך מלא kinesin, אם כי המוח Murine נעשה שימוש גם 12. החיסרון הגדול של שימוש במוח שור כמקור kinesin הוא הזמינות של חומר המוצא טרי: מטבחיים בדרך כלל נגיש, והמוח חייבים להיות טריים מאוד כדי להשיג kinesin פעיל. יתר על כן, רק במוחם של…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
תודה מיוחדת קריס נגאי וג'ייסון דל ריו עבור תמיכתם ועזרתם בפרויקט זה. עבודה זו נתמכה על ידי RO1 מענק GM070676 כדי SPG.
Materials
| Name of the reagent or material | Company | Catalogue number | Comments |
| Agar (Granulated) | Fisher | 1423-500 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous | Fisher | D16-3 | |
| Petri Dishes | Becton | 35 1007 | 60x15mm Style (Polyester) 20/bag |
| Drosophila Culture Vials | UCI | ||
| Tricorn beaker | Econo Lab Inc. | B700-100 | Volume:100ml, size: 58x72mm |
| Yeast | Red Star | 2751 | |
| Nylon Mesh | Genesse Scientific | 57-102 | 120 micron pore size |
| Nylon Mesh | Small Parts | 06-350/35 | |
| Pipes | Sigma | 108321-27-3 | |
| Pipes | Sigma | 108321-27-3 | |
| Glycerol | Fisher | 56-81-5 | |
| EGTA | Sigma | 67-42-5 | |
| MgS04(Anhydrous) | Fisher | 7487-88-9 | |
| PMSF | Sigma | 329-98-6 | |
| Leupeptin | Sigma | 103476-89-7 | |
| Aprotonin | Sigma | 9087-70-1 | |
| TAME | Sigma | 178403-8 | |
| STI | Calbiochem | 65635 | |
| GTP | Sigma | 36051-31-7 | |
| Taxol | Sigma | 33069-62-4 | |
| ATP analog 5′-adenylyl imidodiphosphate | Sigma | 3605-31-7 | |
| NaCl | Mallinckrodt | 7647-14-5 | |
| ATP | Sigma | 74804-12-9 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters: .5 mL, 100kD cut off, 8 pack | Millipore | UFC510008 |
References
- Ashburner, M., Thompson, J. N., Ashburner, M., Wright, T. R. F. The laboratory culture of Drosophila 2A. The genetics and biology of Drosophila. , 1-81 (1978).
- Roberts, D. B. . Drosophila: A Practical Approach. , (1998).
- Kunert, N., Brehm, A. Mass production of Drosophila Embryosand Chromatographic Purification of Native Protein Complexes. Methods in Molecular Biology. 420, 359 (2008).
- Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A., Wilson, L., Matsudaira, P. T., Eds, . Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. 44, (1994).
- Saxton, W. M. Drosophila kinesin: Characterization of microtubule motility and ATPase. Proceedings of the National Academy of Science. 85, 1109 (1988).
- Shubeita, G. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1098 (2008).
- Svoboda, K., Block, S. M. Force and Velocity Measured for Single Kinesin Molecules. Cell. 77, 773 (1994).
- Cole, D. G., Saxton, W. M., Sheehan, K. B., Scholey, J. M. A “Slow” Homotetrameric Kinesin-related Motor Protein Purified from Drosophila embryos. J. Biol. Chem. 269, 22917-22917 (1994).
- Saxton, W. M. Isolation and Analysis of Microtuble Motor Proteins. Drosophila Melanogaster. Bloomington: Academic. 44, 279 (1994).
- Scholey, J. Motility Assay for Motor Proteins. Methods in Cell Biology. 39, 138 (1993).
- Wagner, M. C., Pfister, K., Brody, S., Bloom, G. Purification of kinesin from bovine brain and assay of microtubule-stimulated ATPase activity. Methods in Enzymology. 196, 157 (1991).
- Aizawa, H. Kinesin Family in Murine Nerwous System. The Journal of Cell Biology. 119, 1287-1287 (1992).
- Ori-McKenney, K. M., Xu, J., Gross, S. P., Vallee, R. B. A cytoplasmic dynein tail mutation impairs motor processivity. Nature Cell Biology. 12, 1228-1228 (2010).
