Kinesin İzolasyonu ve Saflaştırılması gelen Drosophila Embriyolar
Summary
Bu aktif tam uzunlukta kinesin izole bir protokoldür<em> Drosophila</em> Tek-molekül biyofiziksel çalışmaları için embriyo. Biz, embriyolar toplamak embriyo lizat olun ve mikrotübüllerin (MTS) polimerize nasıl gösterir. Kinesin, MTs üzerinde hareketsizleştirici kinesin-MT kompleksleri aşağı doğru dönen, ve daha sonra ATP ilave yoluyla MTS kinesin salgılatıcı ile arıtılır.
Abstract
Motor proteinleri mikrotübüllerin boyunca yükler taşımak ve belirli alt-hücresel bir yere taşırlar. Değişmiş ulaşım mikrotübül dayalı motorlu taşıtlar ve düzenlenmesi anlamak, nörodejeneratif hastalıklar çeşitli altında yatan önerilmektedir Çünkü muhtemelen sonuçta daha iyi terapötik yaklaşımlara yol açacaktır. Kinesin-1 ATP hidrolizi powered by mikrotübüllerin (MTS) boyunca bir anterograd (artı uç) yönünde, içinde hareket eden bir ökaryotik motoru proteindir. İşte biz böylece tek-molekül biyofiziksel çalışmalarla Drosophila genetiği kombinasyonu sağlayan, Drosophila embriyo aktif tam uzunlukta kinesin izole etmek için ayrıntılı bir arıtma protokolü sunduk. Fincan başına yaklaşık 1000 kadın ile birlikte, yaklaşık 50 yumurta kapları ile başlayarak, biz bir gecede koleksiyonları yürütülmektedir. Bu paketlenmiş embriyoların yaklaşık 10 ml sağladı. Embriyo (embriyonun yaklaşık 9 gram kadar) dechorionated çamaşır suyu vardı ve sonra homojenize. After bozulması, Homojenat yüksek hızlı santrifüj düşük hızlı dönüş kullanılarak açıklanabilir. Açıklık süpernatan MTs polimerize etmek GTP ve taksol ile muamele edildi. Kinesin ATP analog, oda sıcaklığında, 5'-adenilat imidodiphosphate ekleyerek polimerize MTs üzerinde hareketsiz kılındı. Kinesin bağlandıktan sonra, mikrotübüllerin bir sükroz yastık aracılığıyla yüksek hızda santrifüj ile çöktürülmüştür. Mikrotübül pelet daha sonra yeniden süspansiyon haline getirildi, ve bu işlem tekrarlanmıştır. Son olarak, ATP MTS kinesin serbest bırakmak için ilave edildi. Yüksek hızlı santrifüjleme sonra üstte yüzen madde içindeki kinesin bırakarak, MTs aşağı doğru bükülmüş. Bu kinesin daha arıtılması için bir filtre 100 KD kesme kapalı bir santrifüj kullanılarak filtrasyon tabi tutuldu bölünüp, sıvı nitrojende dondurulmuş ve -80 ° C'de saklanır kapandığından Blotting SDS jel elektroforezi ve batı arıtılmış örnek kullanılarak gerçekleştirildi. Nihai santrifüj süzme aşaması önce ve sonra saflaştırılmış örneklerin motor aktivitein vitro tek bir molekül mikrotübül tayininde kullanılarak değerlendirilmiştir. Daha önce literatürde rapor edilen merkezkaç filtrasyon öncesi ve sonrası kinesin fraksiyonlar processivity gösterdi. Ayrıca deneyler kinesin ve diğer ulaşım ilgili proteinler arasındaki etkileşimi değerlendirmek için çalışmalar devam etmektedir.
Protocol
Discussion
Mürin beyin yanı 12 kullanılmıştır ama Bovine beyin, tam uzunlukta kinesin arındırmak için en yaygın olarak kullanılan başlangıç materyali 11'dir. Bir kinesin kaynağı olarak sığır beyin kullanılarak büyük bir dezavantajı, taze başlangıç malzemesinin mevcut olmasıdır: kesimhanelerinde tipik olarak erişilemez ve beynin aktif kinesin elde edilmesi için son derece taze olmalıdır. Ayrıca, küçük inek, sadece beyinleri etkilidir. Son olarak, ineklerin ge…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kris Ngai ve bu projeye verdikleri destek ve yardım için Jason Del Rio özel teşekkürler. Bu çalışma RO1 SPG için hibe GM070676 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of the reagent or material | Company | Catalogue number | Comments |
| Agar (Granulated) | Fisher | 1423-500 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous | Fisher | D16-3 | |
| Petri Dishes | Becton | 35 1007 | 60x15mm Style (Polyester) 20/bag |
| Drosophila Culture Vials | UCI | ||
| Tricorn beaker | Econo Lab Inc. | B700-100 | Volume:100ml, size: 58x72mm |
| Yeast | Red Star | 2751 | |
| Nylon Mesh | Genesse Scientific | 57-102 | 120 micron pore size |
| Nylon Mesh | Small Parts | 06-350/35 | |
| Pipes | Sigma | 108321-27-3 | |
| Pipes | Sigma | 108321-27-3 | |
| Glycerol | Fisher | 56-81-5 | |
| EGTA | Sigma | 67-42-5 | |
| MgS04(Anhydrous) | Fisher | 7487-88-9 | |
| PMSF | Sigma | 329-98-6 | |
| Leupeptin | Sigma | 103476-89-7 | |
| Aprotonin | Sigma | 9087-70-1 | |
| TAME | Sigma | 178403-8 | |
| STI | Calbiochem | 65635 | |
| GTP | Sigma | 36051-31-7 | |
| Taxol | Sigma | 33069-62-4 | |
| ATP analog 5′-adenylyl imidodiphosphate | Sigma | 3605-31-7 | |
| NaCl | Mallinckrodt | 7647-14-5 | |
| ATP | Sigma | 74804-12-9 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters: .5 mL, 100kD cut off, 8 pack | Millipore | UFC510008 |
References
- Ashburner, M., Thompson, J. N., Ashburner, M., Wright, T. R. F. The laboratory culture of Drosophila 2A. The genetics and biology of Drosophila. , 1-81 (1978).
- Roberts, D. B. . Drosophila: A Practical Approach. , (1998).
- Kunert, N., Brehm, A. Mass production of Drosophila Embryosand Chromatographic Purification of Native Protein Complexes. Methods in Molecular Biology. 420, 359 (2008).
- Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A., Wilson, L., Matsudaira, P. T., Eds, . Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. 44, (1994).
- Saxton, W. M. Drosophila kinesin: Characterization of microtubule motility and ATPase. Proceedings of the National Academy of Science. 85, 1109 (1988).
- Shubeita, G. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1098 (2008).
- Svoboda, K., Block, S. M. Force and Velocity Measured for Single Kinesin Molecules. Cell. 77, 773 (1994).
- Cole, D. G., Saxton, W. M., Sheehan, K. B., Scholey, J. M. A “Slow” Homotetrameric Kinesin-related Motor Protein Purified from Drosophila embryos. J. Biol. Chem. 269, 22917-22917 (1994).
- Saxton, W. M. Isolation and Analysis of Microtuble Motor Proteins. Drosophila Melanogaster. Bloomington: Academic. 44, 279 (1994).
- Scholey, J. Motility Assay for Motor Proteins. Methods in Cell Biology. 39, 138 (1993).
- Wagner, M. C., Pfister, K., Brody, S., Bloom, G. Purification of kinesin from bovine brain and assay of microtubule-stimulated ATPase activity. Methods in Enzymology. 196, 157 (1991).
- Aizawa, H. Kinesin Family in Murine Nerwous System. The Journal of Cell Biology. 119, 1287-1287 (1992).
- Ori-McKenney, K. M., Xu, J., Gross, S. P., Vallee, R. B. A cytoplasmic dynein tail mutation impairs motor processivity. Nature Cell Biology. 12, 1228-1228 (2010).
