Isolering og oprensning af kinesin fra Drosophila Embryoner
Summary
Dette er en protokol til at isolere aktive fuld længde kinesin fra<em> Drosophila</em> Embryoner til enkelt-molekyle biofysiske undersøgelser. Vi viser, hvordan at indsamle embryoner, gør embryo lysatet, og derefter polymerisere mikrotubuli (MT). Kinesin oprenses ved at immobilisere det på MT-, spinde ned kinesin-MT komplekser, og derefter at frigive kinesin fra MT via ATP tilsætning.
Abstract
Motor proteiner bevæger ladninger langs mikrotubuli, og transportere dem til specifikke sub-cellulære steder. Fordi ændrede transport foreslås at ligge til grund for en række neurodegenerative sygdomme, forståelse mikrotubuli baseret motor transporten og dens regulering vil sandsynligvis i sidste ende føre til bedre behandlingsmetoder. Kinesin-1 er en eukaryot motor protein, som bevæger sig i en anterograd (plus-ende) langs mikrotubuli (MT), drevet af ATP hydrolyse. Her rapporterer vi en detaljeret oprensning protokol til isolering af aktive fuld længde kinesin fra Drosophila-embryoner, således at kombinationen af Drosophila genetik med enkelt-molekyle biofysiske undersøgelser. Startende med cirka 50 æglæggende kopper, med cirka 1000 kvinder pr kop, vi gennemførte natten samlinger. Dette gav cirka 10 ml pakkede æg. Embryonerne blev blegemiddel dechorionated (gav ca 9 g embryoner) og derefter homogeniseret. After forstyrrelser, blev homogenatet klarlagt ved hjælp af en centrifugering med lav hastighed efterfulgt af en højhastighedscentrifugering. Den klarede supernatant blev behandlet med GTP og taxol at polymerisere MTS. Kinesin blev immobiliseret på polymeriseret MT'er ved tilsætning af ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate ved stuetemperatur. Efter kinesin binding blev mikrotubuli sedimenteret ved høj hastighed centrifugering gennem en saccharosepude. Det mikrotubulus Pelleten blev derefter resuspenderet, og denne proces blev gentaget. Endelig blev ATP tilsat for at frigøre kinesin fra MTS. Højhastighedscentrifugering derefter spundet ned MTS, forlader kinesin i supernatanten. Dette kinesin blev underkastet en centrifugal filtrering under anvendelse af en 100 kD cutoff filter for yderligere oprensning, alikvoteret, lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C. SDS-gelelektroforese og Western blotting blev udført under anvendelse af oprenset prøve. Den motoriske aktivitet oprensede prøver før og efter det sidste centrifugalfiltreringsenheden trinblev evalueret under anvendelse af en de vitro enkelt molekyle mikrotubulus-assay. De kinesin fraktioner før og efter centrifugal filtrering viste processivitet som tidligere rapporteret i litteraturen. Yderligere eksperimenter er i gang med at vurdere samspillet mellem kinesin og andre transportrelaterede proteiner.
Protocol
Discussion
Bovin hjerne er det mest anvendte udgangsmateriale 11 til oprensning i fuld længde kinesin, selvom murine hjerne er blevet anvendt som brønden 12. En stor ulempe ved anvendelse af bovin hjerne som kinesin kilde er tilgængeligheden af frisk udgangsmateriale: slagterier er typisk utilgængelige, og hjernen være yderst frisk for at opnå aktive kinesin. Yderligere kun hjernerne hos unge køer er effektive. Endelig, genetisk manipulation af køer er i øjeblikket ikke er en farbar vej, kan s?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Særlig tak til Kris Ngai og Jason Del Rio for deres støtte og hjælp i dette projekt. Dette arbejde blev støttet af RO1 tilskud GM070676 til SPG.
Materials
| Name of the reagent or material | Company | Catalogue number | Comments |
| Agar (Granulated) | Fisher | 1423-500 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous | Fisher | D16-3 | |
| Petri Dishes | Becton | 35 1007 | 60x15mm Style (Polyester) 20/bag |
| Drosophila Culture Vials | UCI | ||
| Tricorn beaker | Econo Lab Inc. | B700-100 | Volume:100ml, size: 58x72mm |
| Yeast | Red Star | 2751 | |
| Nylon Mesh | Genesse Scientific | 57-102 | 120 micron pore size |
| Nylon Mesh | Small Parts | 06-350/35 | |
| Pipes | Sigma | 108321-27-3 | |
| Pipes | Sigma | 108321-27-3 | |
| Glycerol | Fisher | 56-81-5 | |
| EGTA | Sigma | 67-42-5 | |
| MgS04(Anhydrous) | Fisher | 7487-88-9 | |
| PMSF | Sigma | 329-98-6 | |
| Leupeptin | Sigma | 103476-89-7 | |
| Aprotonin | Sigma | 9087-70-1 | |
| TAME | Sigma | 178403-8 | |
| STI | Calbiochem | 65635 | |
| GTP | Sigma | 36051-31-7 | |
| Taxol | Sigma | 33069-62-4 | |
| ATP analog 5′-adenylyl imidodiphosphate | Sigma | 3605-31-7 | |
| NaCl | Mallinckrodt | 7647-14-5 | |
| ATP | Sigma | 74804-12-9 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters: .5 mL, 100kD cut off, 8 pack | Millipore | UFC510008 |
References
- Ashburner, M., Thompson, J. N., Ashburner, M., Wright, T. R. F. The laboratory culture of Drosophila 2A. The genetics and biology of Drosophila. , 1-81 (1978).
- Roberts, D. B. . Drosophila: A Practical Approach. , (1998).
- Kunert, N., Brehm, A. Mass production of Drosophila Embryosand Chromatographic Purification of Native Protein Complexes. Methods in Molecular Biology. 420, 359 (2008).
- Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A., Wilson, L., Matsudaira, P. T., Eds, . Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. 44, (1994).
- Saxton, W. M. Drosophila kinesin: Characterization of microtubule motility and ATPase. Proceedings of the National Academy of Science. 85, 1109 (1988).
- Shubeita, G. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1098 (2008).
- Svoboda, K., Block, S. M. Force and Velocity Measured for Single Kinesin Molecules. Cell. 77, 773 (1994).
- Cole, D. G., Saxton, W. M., Sheehan, K. B., Scholey, J. M. A “Slow” Homotetrameric Kinesin-related Motor Protein Purified from Drosophila embryos. J. Biol. Chem. 269, 22917-22917 (1994).
- Saxton, W. M. Isolation and Analysis of Microtuble Motor Proteins. Drosophila Melanogaster. Bloomington: Academic. 44, 279 (1994).
- Scholey, J. Motility Assay for Motor Proteins. Methods in Cell Biology. 39, 138 (1993).
- Wagner, M. C., Pfister, K., Brody, S., Bloom, G. Purification of kinesin from bovine brain and assay of microtubule-stimulated ATPase activity. Methods in Enzymology. 196, 157 (1991).
- Aizawa, H. Kinesin Family in Murine Nerwous System. The Journal of Cell Biology. 119, 1287-1287 (1992).
- Ori-McKenney, K. M., Xu, J., Gross, S. P., Vallee, R. B. A cytoplasmic dynein tail mutation impairs motor processivity. Nature Cell Biology. 12, 1228-1228 (2010).
