プルダウンカルモジュリン結合タンパク質の

Summary

カルモジュリン（CaM）プルダウンアッセイは、様々なタンパク質とカルモジュリンの相互作用を調査するために効果的な方法です。このメソッドは、CAM -結合タンパク質の効率的かつ特定の分析のためのCaM -セファロースビーズを使用しています。これは、細胞機能のCAM信号を探索するための重要なツールが用意されています。

Abstract

カルシウム（Ca ^{2 +）は、}さまざまなメカニズムを通じて細胞機能の調節に重要なイオンで ​​す。多くのCa ^{2 +}のシグナリングは、カルモジュリン^（CaM）1,2として知られているカルシウム結合タンパク質によって媒介される。 CAMは、アポトーシス、代謝、平滑筋収縮、シナプス可塑性、神経の成長、炎症と免疫応答を含むほぼすべての細胞プロセス、内の複数のレベルで関与している。タンパク質の数は、CAMとの相互作用を介してこれらの経路を調節するのに役立ちます。これらの相互作用の多くは、Ca ²にバインドされたときに明らかに異なっているCAMのコンフォメーション^、+（のCa ^{2 +} – CaMの）としてのCa ^{2 +} -フリー状態^{（ApoCaM）3}とは対照的に依存する。

ほとんどの標的タンパク質は、Ca ^{2 +} – CaMのをバインドしながら、特定のタンパク質だけApoCaMに結合する。ニューロ^4、ニューログラニン（呉^）5、および特定のミオシンを含む彼らのIQ -ドメインを介して、いくつかのバインドCAM、 <sup> 6。これらのタンパク質はそれぞれ、前シナプス機能^7、シナプス機能^8、および筋収縮⁹の重要な役割を果たすことが示されている。結合し、Ca ^{2 +}の存在下または存在下でCAMをリリースする⁺能力は、それらの機能に極めて重要である。対照的に、多くのタンパク質は唯一のCa ^{2 +} – CaMの結合し、それらの活性化のため、このバインディングを必要とする。例としては、ミオシン軽鎖キナーゼ¹⁰のCa ^{2 +} /カルモジュリン依存性キナーゼ^{（CaMKs）11}とホスファターゼ（例えばカルシニューリン^）12、及び直接的および下流効果¹⁴のバリエーションがスペクトリンキナーゼ^13を 、含まれています。

細胞機能に対するこれらのタンパク質の効果は、通常のCa ^{2 +}依存的にCAMに結合する能力に依存しています。例えば、我々は、シナプス機能とどのように異なる突然変異は、この結合に影響を与えるのNG – CaMの結合の妥当性をテストした。我々は、GFPタグ付き伍CONを生成のCa ^{2 +}依存的にCAMをバインドするために呉の能力を変更するようなIQ -ドメイン内の特定の変異を持つ構造体。これらの異なる突然変異の研究は、シナプス機能^8,15に関与する重要なプロセスに私たちに偉大な洞察力を与えた。しかし、このような研究で、それは変異タンパク質が予想されるのCaMへの結合を変更していることを証明するために不可欠です。

ここで、我々は、例としてCaMKIIとngを使用して、Ca ^{2 +}の存在下または非存在下でCAMに結合するタンパク質の能力をテストするための手法を提案する。このメソッドは、CaMとプルダウンアッセイと呼ばれるアフィニティークロマトグラフィーの形です。それは、CaMと⁺この結合に対するCa ^{2 +}の影響に結合するタンパク質をテストするためのCaM -セファロースビーズを使用しています。それは、効率的なかなり多くの時間であり、カラムクロマトグラフィーおよび他のアッセイの相対少ない蛋白質を必要とします。完全に、これはでているのCa ^{2 +} /カルモジュリンのシグナル伝達やタンパク質を探索するために貴重なツールを提供します。CAMとteract。

Protocol

ホモジネートで始まる手続きの基本的な回路図は図1を参照してください。細胞抽出物の作成からCAM -結合タンパク質の溶出に要する時間は約6〜7時間です。 1。組織の準備目的の組換えタンパク質を発現するプラスミドを含有するウイルスと器官型海馬スライス（この例では、緑色蛍光タンパク質（GFP）タグ付きng）を注入し、組織が一晩タンパク質を発現するこ?…

Discussion

提供するプロトコルは、CAM -結合蛋白質のCa ^{2 +} -依存性を調査するようにCAM -セファロースビーズを利用しています。多くのタンパク質は、Ca ^{2 +}依存的にカルモジュリンを結合する。これらの相互作用は、多くのシグナル伝達経路におけるカルモジュリン結合タンパク質およびそれらの重要な役割の数は与えられた非常に重要です。このプロトコルでは、CAM -セファロースビー?…

Materials

Product	Company	Catalogue number	Notes
Calmodulin-Sepharose beads	GE Healthcare	17-0529-01
Anti-CamKII alpha	Sigma-Aldrich	C6974
Anti-neurogranin	Millipore	07-425
Gel Loading Pipet Tips	Fisher	02-707-138	Use for aspiration of supernatants
Microcentrifuge tubes (2.0 mL)	Fisher	05-408-146	Use for all steps involving calmodulin-sepharose beads