Immunocoloration des Disséqué coeur embryonnaire Zebrafish

Résumé

Un moyen rapide pour effectuer immunocoloration des embryons de poisson zèbre coeur est décrite. Comparativement à l'approche immunologique monter ensemble, cette méthode augmente considérablement la pénétration de l'anticorps, ce qui permet d'obtenir des images haute résolution qui révèlent des structures cellulaires / subcellulaires dans le coeur dans un temps de traitement beaucoup plus réduite.

Résumé

L'embryon de poisson zèbre devient un populaire dans le modèle in vivo pour l'étude des vertébrés développement cardiaque et les maladies cardiaques humaines en raison de sa embryologie et la génétique avantageuse ^1,2. Environ 100-200 embryons sont disponibles chaque semaine d'un seul couple de poissons adultes. Les embryons transparents qui se développent ex utero les rendent idéales pour évaluer les défauts cardiaques ^3. L'expression de tout gène peut être manipulé par l'intermédiaire morpholino la technologie d'injection ou de l'ARN ^4. Par ailleurs, avant de cribles génétiques ont déjà généré une liste de mutants qui affectent différentes perspectives de cardiogenèse ^5.

Whole immunomarquage de montage est une technique importante dans ce modèle animal de révéler le profil d'expression de la protéine ciblée à un tissu particulier ^6. Toutefois, les images à haute résolution qui peut révéler des structures cellulaires ou subcellulaires ont été difficiles, principalement en raison de la locat physiquesion du cœur et la faible pénétration de l'anticorps.

Ici, nous présentons une méthode pour répondre à ces goulots d'étranglement en disséquant le cœur d'abord et ensuite la conduite du processus de taches sur la surface d'une lame de microscope. Pour éviter la perte des échantillons de petit coeur et pour faciliter la manipulation solution, nous avons limité les échantillons coeur dans un cercle à la surface du microscope diapositives tirées par un stylo immEdge. Après la coloration, les signaux de fluorescence peut être directement observé par un microscope composé.

Notre nouvelle méthode améliore significativement la pénétration des anticorps, car un cœur à partir d'un embryon de poisson ne se compose que de quelques couches de cellules. Des images de haute qualité de coeurs intacts peuvent être obtenus dans un délai très réduit pour le défilé des embryons de poisson zèbre âgés de jour 2 au jour 6. Notre méthode peut être potentiellement étendue à d'autres organes disséqués tache soit de poisson zèbre ou autres petits animaux.

Protocole

1. Préparation des lames et la chambre humidifié

1. La chambre humide peut être faite d'une boîte comme une boîte de pointe vidé. Enveloppez la fois la chambre et le couvrir de papier aluminium pour protéger les échantillons de la lumière.
2. A l'intérieur de la chambre, mettre une pile de serviettes en papier humide pour maintenir l'humidité dans la chambre, ce qui empêchera les échantillons coeur de sécher. Régler une microplaque petits sur le dessus de serviette en papier comme un support pour les diapos.
3. Dessinez des lignes ou des cercles, soit sur la surface d'une lame de microscope à l'aide du stylet pour faire immEdge puits pour les éc....

Discussion

Comparé à l'ensemble des méthodes classiques immunomarquage monter, notre méthode présente les avantages suivants. D'abord, beaucoup plus fort des signaux fluorescents peuvent être systématiquement obtenu grâce à une meilleure pénétration. Dans la méthode immunologique monter ensemble, les tissus de la peau épaisse qui entoure le cœur significativement réduit la pénétration de nombreux anticorps, résultant en bruit de fond élevé dans le corps entier. Ce problème est particulièrement grave pour les embryons âgés .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue
tricaïne	Organiques de recherche	3007T
Formaldéhyde	Polysciences	04018
Seringue à insuline	Becton Dickinson	329461
Triton-X-100	Sigma	T8532
Anti-β-caténine d'anticorps	Sigma	C7207
Anti-Mef2c d'anticorps	Santa Cruz Biotech	SC313
F59	Zfin
Anti-α-actinine d'anticorps	Sigma	A7811
Anti-Ilk d'anticorps	La signalisation cellulaire	# 3862
Alexa Fluor 568 de chèvre anti IgG de lapin td>	Invitrogen	A11011
Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris IgG1	Invitrogen	A21121
Milieu de montage pour la fluorescence	Vecteur	H-1200
ImmEdge stylo	Vecteur	H-4000
Poly-L-lysine lames revêtues	La microscopie électronique en sciences	63410-01
Couvercle en verre de microscope	Fisher	12 à 543-D
Lames de microscope concave	Fisher	7-1305-8
Microscope à dissection	Leica MZ95
Microscope composé	Zeiss	Axioplan2
ApoTome	Zeiss

PBST:
1 x PBS
0,5% de Triton X-100

ent "> 25X tricaïne:
400 mg de tricaïne
97,9 ml ddH ₂ O
2,1 ml (1M Tris pH9)
Ajuster le pH à 7,0