Visualisatie van vasculaire Ca 2 + Signalering Geactiveerd door Paracriene Derived ROS
Summary
Een efficiënte methode om inzicht te krijgen in het visualiseren van de paracriene afgeleide ROS inductie van endotheliale Ca2 + signalering wordt beschreven. Deze methode maakt gebruik van het meten van paracriene afgeleid ROS geactiveerd Ca2 + mobilisatie in vasculaire endotheliale cellen in een co-cultuur model.
Abstract
Oxidatieve stress is betrokken bij een aantal pathologische condities waaronder ischemie / reperfusie schade en sepsis. Het concept van oxidatieve stress verwijst naar de afwijkende vorming van ROS (reactive oxygen species), die O 2 • omvatten -, H 2 O 2, en hydroxyl radicalen. Reactive oxygen species invloeden een veelheid van cellulaire processen zoals signaaltransductie, celproliferatie en celdood 1-6. ROS hebben het potentieel om van bloedvaten en organen cellen direct schade aan, en kan initiëren secundaire chemische reacties en genetische veranderingen die uiteindelijk resulteren in een versterking van de eerste ROS-gemedieerde weefselschade. Een belangrijk onderdeel van de versterking cascade die onomkeerbare weefselschade verergert is de werving en activering van circulerende ontstekingscellen. Tijdens de ontsteking, inflammatoire cellen produceren cytokines zoals tumor necrose factor-α (TNFa) en IL-1 dieActiveer endotheelcellen (EC) en epitheliale cellen en verder vergroten van de ontstekingsreactie 7. Vasculaire endotheliale dysfunctie is een vast onderdeel van de acute ontsteking. Macrofagen bijdragen aan de endotheliale dysfunctie bij een ontsteking door middel van mechanismen die onduidelijk blijven. Activatie van macrofagen resulteert in de extracellulaire vrijgave van O 2 • – en verschillende pro-inflammatoire cytokines, die pathologische signalering in aangrenzende cellen acht triggers. NADPH oxidasen zijn de grote en belangrijkste bron van ROS in de meeste celtypen. Onlangs is aangetoond door ons en anderen 9,10 dat ROS geproduceerd door NADPH oxidasen de mitochondriale ROS productie gedurende vele pathofysiologische omstandigheden induceren. Vandaar dat het meten van de mitochondriale ROS productie is even belangrijk als aanvulling op het meten van cytosolische ROS. Macrofagen produceren ROS door de flavoprotein enzym NADPH oxidase, die een primaire rol bij ontstekingen speelt. Eenmaal geactiveerd,fagocytaire NADPH oxidase produceert grote hoeveelheden van O 2 • – die van belang zijn in de ontvangende afweermechanisme 11,12. Hoewel de paracriene-afgeleide O 2 • – speelt een belangrijke rol in de pathogenese van vasculaire ziekten, visualisatie van paracriene ROS-geïnduceerde intracellulaire signalering met inbegrip van Ca 2 + mobilisatie is nog steeds hypothese. We hebben een model ontwikkeld waarin de geactiveerde macrofagen worden gebruikt als een bron van O 2 • – om een signaal te transduceren aan aangrenzende endotheelcellen. Met behulp van dit model tonen we aan dat de macrofaag afgeleide O 2 • – leiden tot een calcium signalisatie in aangrenzende endotheelcellen.
Protocol
Discussion
De hier beschreven methode maakt een snelle en kwantitatieve meting van zuurstofradicalen in levende cellen hetzij met behulp van oxidatie gevoelige kleurstoffen of plasmide sensoren. Agonisten van TLR (Toll-like receptoren) zijn verbindingen die de cellen te stimuleren door middel van de TLR's aanwezig op het celoppervlak en leiden tot de stroomafwaartse signaalwegen 15. In ons protocol, gebruikten we drie verschillende TLR-agonisten te weten, Lipo-teichoic zuur-TLR2 agonist, Poly (I: C). TLR3-agonist; L…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health-subsidie (R01 HL086699, HL086699-01A2S1, 1S10RR027327-01) naar MM. Ons artikel wordt mede ondersteund door Carl Zeiss microimaging LLC.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A7816 |
| Antimycin A | Sigma Aldrich | A8674 |
| DMEM low glucose medium | Invitrogen | 10567-014 |
| Endothelial growth factor supplement (ECGS) | Upstate | 02-102 |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 12662011 |
| G418 | Invitrogen | 10131-027 |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G1393 |
| H2DCFDA | Invitrogen | D-399 |
| LPS | Sigma Aldrich | L4516 |
| LTA | Sigma Aldrich | L2515 |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen | 51985091 |
| Pen/Strep (10x) | Invitrogen | 15140163 |
| pHyPer-cyto | Evrogen | FP941 |
| pHyPer-dMito | Evrogen | FP942 |
| Poly(I:C) | Sigma Aldrich | P0913 |
| Prism software 5.0 | GraphPad Software, Inc. | |
| SigmaPlot 11.0 | Systat software, Inc. | |
| Trypsin-EDTA (10x) | Invitrogen | 15400054 |
| T-25 Flasks | Corning | 430639 |
| T-75 Flasks | BD Falcon | 353136 |
| 96-well TC micro well plate | BD Falcon | 353072 |
| Zen 2009 software | Carl Zeiss 510 Meta confocal microscopy |
References
- Madesh, M. Selective role for superoxide in InsP3 receptor-mediated mitochondrial dysfunction and endothelial apoptosis. J. Cell. Biol. 170, 1079-1090 (2005).
- Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol. Rev. 82, 47-95 (2002).
- Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes. Trends Biochem. Sci. 35, 505-513 .
- Hawkins, B. J. S-glutathionylation activates STIM1 and alters mitochondrial homeostasis. J. Cell. Biol. 190, 391-405 (2010).
- Madesh, M., Hajnoczky, G. VDAC-dependent permeabilization of the outer mitochondrial membrane by superoxide induces rapid and massive cytochrome c release. J. Cell Biol. 155, 1003-1015 (2001).
- Finkel, T., Holbrook, N. J. Oxidants oxidative stress and the biology of ageing. Nature. 408, 239-247 (2000).
- Rittirsch, D., Flierl, M. A., Ward, P. A. Harmful molecular mechanisms in sepsis. Nat. Rev. Immunol. 8, 776-787 (2008).
- Sanlioglu, S. Lipopolysaccharide induces Rac1-dependent reactive oxygen species formation and coordinates tumor necrosis factor-alpha secretion through IKK regulation of NF-kappa. 276, 30188-30198 (2001).
- Hawkins, B. J., Madesh, M., Kirkpatrick, C. J., Fisher, A. B. Superoxide flux in endothelial cells via the chloride channel-3 mediates intracellular signaling. Mol. Biol. Cell. 18, 2002-2012 (2007).
- Vliet, A. v. a. n. d. e. r. NADPH oxidases in lung biology and pathology: host defense enzymes and more. Free Radic. Biol. Med. 44, 938-955 (2008).
- Babior, B. M., Kipnes, R. S., Curnutte, J. T. Biological defense mechanisms. The production by leukocytes of superoxide, a potential bactericidal agent. J. Clin. Invest. 52, 741-744 (1973).
- Lambeth, J. D. NOX enzymes and the biology of reactive oxygen. Nat. Rev. Immunol. 4, 181-189 (2004).
- Mukhopadhyay, P. Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy. Nat. Protoc. 2, 2295-2301 (2007).
- Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459, 996-999 (2009).
- Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity. Nat. Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).
