تصور كا الأوعية الدموية 2 + اشارة سببها ريوس المشتقة نظير الصماوي
Summary
وصفت وسيلة فعالة للحصول على نظرة ثاقبة الرؤية والاستقراء ريوس نظير الصماوي المستمدة من البطانية إشارة + CA2. هذا الأسلوب يستفيد من قياس نظير الصماوي ريوس المستمدة أثار CA2 + تعبئة الخلايا البطانية في الأوعية الدموية في نموذج شارك في الثقافة.
Abstract
وقد تورط الاكسدة في عدد من الظروف المرضية بما في ذلك نقص التروية / ضخه الأضرار والتسمم. مفهوم الاكسدة يشير إلى تشكيل الشاذة من ريوس (أنواع الاكسجين التفاعلية) ، والتي تشمل • O 2 — ، H 2 O 2 ، وجذور الهيدروكسيل. أنواع الاكسجين التفاعلية التأثيرات العديد من العمليات الخلوية بما في ذلك نقل الإشارة ، وانتشار الخلايا وموت الخلايا 1-6. ROS لديها القدرة على الأوعية الدموية وتلف خلايا الجهاز مباشرة ، ويمكن الشروع في التفاعلات الكيميائية الثانوية والتعديلات الوراثية التي تؤدي في نهاية المطاف في التضخيم من الأضرار الأولية بوساطة نسيج ريوس. ومن المكونات الرئيسية لتتالي التضخيم الذي لا رجعة فيه تفاقم تلف الأنسجة هو توظيف وتفعيل تعميم الخلايا الالتهابية. أثناء الالتهاب ، وإنتاج السيتوكينات الالتهابية الخلايا مثل نخر الورم عامل α (TNFα) ، وأنه IL – 1تنشيط الخلايا البطانية (EC) والخلايا الظهارية ، وكذلك زيادة 7 الاستجابة الالتهابية. خلل بطانة الأوعية الدموية هي ميزة أنشئت من التهاب حاد. الضامة تساهم في اختلال وظيفي التهاب بطانة خلال الآليات التي لا تزال غامضة. تفعيل نتائج الضامة خارج الخلايا في الإفراج عن O 2 • — والعديد من السيتوكينات الموالية للالتهابات ، والتي يطلق إشارات مرضية في الخلايا المجاورة 8. oxidases NADPH هي المصدر الرئيسي والأساسي للروس في معظم أنواع الخلايا. في الآونة الأخيرة ، فإنه يظهر من قبلنا وغيرها 9،10 ريوس أن تنتجها oxidases NADPH تحفز إنتاج ريوس الميتوكوندريا خلال ظروف الفيزيولوجية المرضية كثيرة. وبالتالي قياس إنتاج ريوس الميتوكوندريا هي نفس القدر من الأهمية ، بالإضافة إلى قياس عصاري خلوي ريوس. الضامة تنتج ريوس من NADPH أوكسيديز انزيم بروتين فلافيني الذي يلعب دورا رئيسيا في التهاب. تنشيط مرة واحدة ،NADPH أوكسيديز أكلة تنتج كميات وفيرة من O 2 • — التي تعتبر مهمة في الآلية الدفاعية للمضيف 11،12. على الرغم من نظير الصماوي المستمدة من O 2 • — يلعب دورا هاما في التسبب في أمراض الأوعية الدموية ، والتصور من الإشارات التي يسببها ريوس نظير الصماوي الخلايا بما في ذلك تعبئة كا 2 + لا تزال الفرضية. وقد طورنا نموذجا والتي تستخدم في تنشيط البلاعم كمصدر لل• O 2 — لتنبيغ إشارة إلى الخلايا البطانية المجاورة. باستخدام هذا النموذج الذي يثبت أن بلعم المستمدة من O 2 • — أن يؤدي إلى إشارات الكالسيوم في الخلايا البطانية المجاورة.
Protocol
Discussion
وصف طريقة القياس هنا يسمح السريع وكمية من أنواع الاكسجين التفاعلية في الخلايا الحية إما باستخدام الأصباغ الأكسدة حساسة أو أجهزة الاستشعار البلازميد. منبهات من TLRs (مثل مستقبلات تول) هي المركبات التي تحفز الخلايا من خلال TLRs موجودة على سطح الخلية وتحريك مسارات إشارات ا…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح (R01 HL086699 ، HL086699 – 01A2S1 ، 1S10RR027327 – 01) إلى MM. معتمد جزئيا مقالتنا التي Microimaging كارل زايس م.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A7816 |
| Antimycin A | Sigma Aldrich | A8674 |
| DMEM low glucose medium | Invitrogen | 10567-014 |
| Endothelial growth factor supplement (ECGS) | Upstate | 02-102 |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 12662011 |
| G418 | Invitrogen | 10131-027 |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G1393 |
| H2DCFDA | Invitrogen | D-399 |
| LPS | Sigma Aldrich | L4516 |
| LTA | Sigma Aldrich | L2515 |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen | 51985091 |
| Pen/Strep (10x) | Invitrogen | 15140163 |
| pHyPer-cyto | Evrogen | FP941 |
| pHyPer-dMito | Evrogen | FP942 |
| Poly(I:C) | Sigma Aldrich | P0913 |
| Prism software 5.0 | GraphPad Software, Inc. | |
| SigmaPlot 11.0 | Systat software, Inc. | |
| Trypsin-EDTA (10x) | Invitrogen | 15400054 |
| T-25 Flasks | Corning | 430639 |
| T-75 Flasks | BD Falcon | 353136 |
| 96-well TC micro well plate | BD Falcon | 353072 |
| Zen 2009 software | Carl Zeiss 510 Meta confocal microscopy |
References
- Madesh, M. Selective role for superoxide in InsP3 receptor-mediated mitochondrial dysfunction and endothelial apoptosis. J. Cell. Biol. 170, 1079-1090 (2005).
- Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol. Rev. 82, 47-95 (2002).
- Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes. Trends Biochem. Sci. 35, 505-513 .
- Hawkins, B. J. S-glutathionylation activates STIM1 and alters mitochondrial homeostasis. J. Cell. Biol. 190, 391-405 (2010).
- Madesh, M., Hajnoczky, G. VDAC-dependent permeabilization of the outer mitochondrial membrane by superoxide induces rapid and massive cytochrome c release. J. Cell Biol. 155, 1003-1015 (2001).
- Finkel, T., Holbrook, N. J. Oxidants oxidative stress and the biology of ageing. Nature. 408, 239-247 (2000).
- Rittirsch, D., Flierl, M. A., Ward, P. A. Harmful molecular mechanisms in sepsis. Nat. Rev. Immunol. 8, 776-787 (2008).
- Sanlioglu, S. Lipopolysaccharide induces Rac1-dependent reactive oxygen species formation and coordinates tumor necrosis factor-alpha secretion through IKK regulation of NF-kappa. 276, 30188-30198 (2001).
- Hawkins, B. J., Madesh, M., Kirkpatrick, C. J., Fisher, A. B. Superoxide flux in endothelial cells via the chloride channel-3 mediates intracellular signaling. Mol. Biol. Cell. 18, 2002-2012 (2007).
- Vliet, A. v. a. n. d. e. r. NADPH oxidases in lung biology and pathology: host defense enzymes and more. Free Radic. Biol. Med. 44, 938-955 (2008).
- Babior, B. M., Kipnes, R. S., Curnutte, J. T. Biological defense mechanisms. The production by leukocytes of superoxide, a potential bactericidal agent. J. Clin. Invest. 52, 741-744 (1973).
- Lambeth, J. D. NOX enzymes and the biology of reactive oxygen. Nat. Rev. Immunol. 4, 181-189 (2004).
- Mukhopadhyay, P. Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy. Nat. Protoc. 2, 2295-2301 (2007).
- Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459, 996-999 (2009).
- Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity. Nat. Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).
