ויזואליזציה של כלי דם Ca 2 + איתות מופעלות על ידי ROS נגזר אוטוקריני
Summary
שיטה יעילה כדי להשיג תובנות לדמיין את האינדוקציה אוטוקריני הנגזרות ROS של האנדותל Ca2 + איתות מתואר. שיטה זו מנצלת את מדידת ROS נגזר אוטוקריני מופעלות Ca2 + לגיוס בתאי האנדותל בכלי הדם במודל שיתוף תרבות.
Abstract
סטרס חמצוני היה מעורב במספר מצבים פתולוגיים כולל נזק איסכמיה / reperfusion ועל אלח דם. הרעיון של סטרס חמצוני מתייחס היווצרות חריגה של ROS (מינים חמצן תגובתי), אשר כוללים • O 2 -, H 2 O 2, רדיקלים הידרוקסיל. מינים החמצן מגיב משפיע שפע של תהליכים תאיים כולל התמרה האות, התפשטות תאים ומוות התא 1-6. ROS יש פוטנציאל נזק בכלי הדם ותאי איבר ישירות, והוא יכול ליזום תגובות כימיות משני שינויים גנטיים כי בסופו של דבר לגרום הגברה של הנזק ROS בתיווך הראשוני רקמות. רכיב מרכזי של מפל הגברה המחזקת נזק בלתי הפיך לרקמות הוא גיוס והפעלה של מחזורי תאים דלקתיים. במהלך דלקת, תאים דלקתיים לייצר ציטוקינים כגון נמק הגידול גורם-α (TNFα) ו-IL-1 כילהפעיל בתאי האנדותל (EC) ותאי אפיתל נוספת להגדיל את 7 התגובה הדלקתית. תפקוד אנדותל כלי דם הוא תכונה הוקמה דלקת חריפה. המקרופאגים לתרום תפקוד אנדותל במהלך דלקת על ידי המנגנונים אינם ברורים. הפעלה של תוצאות מקרופאגים לשחרור תאיים של O 2 • – שונות הפרו ציטוקינים דלקתיים, אשר מפעילה איתות פתולוגיים בתאים סמוכים 8. Oxidases NADPH הם המקור העיקרי והראשון במעלה של ROS ברוב סוגי התאים. לאחרונה, היא מופיעה על ידינו ואחרים 9,10 כי ROS המיוצר על ידי oxidases NADPH לעורר את הייצור המיטוכונדריאלי ROS במהלך תנאי pathophysiological רבים. מכאן מדידת הייצור המיטוכונדריאלי ROS חשוב לא פחות בנוסף למדידת cytosolic ROS. המקרופאגים מייצרים ROS על ידי האנזים מונואמין NADPH flavoprotein אשר ממלא תפקיד העיקרי לדלקת. הופעל פעם אחת,NADPH אוקסידאז phagocytic מייצרת כמויות עצומות של O 2 • – חשובים במנגנון ההגנה המארחת 11,12. למרות אוטוקריני הנגזרות O 2 • – ממלא תפקיד חשוב בפתוגנזה של מחלות כלי הדם, ויזואליזציה של ROS-Induced אוטוקריני איתות תאיים, כולל גיוס Ca 2 + עדיין השערה. פיתחנו מודל שבו מקרופאגים מופעל משמשים כמקור של O 2 • – כדי transduce איתות לתאי אנדותל סמוכים. באמצעות מודל זה אנו מראים כי macrophage הנגזרות O 2 • – להוביל סידן איתות לתאי אנדותל סמוכים.
Protocol
Discussion
השיטה המתוארת כאן מאפשר מדידה כמותית מהירה של מינים חמצן תגובתי בתאים חיים או באמצעות צבעים חמצון רגיש או חיישנים פלסמיד. אגוניסטים של TLRs (קולטני Toll-כמו) הם תרכובות לגרות את התאים דרך TLRs הנוכחי על פני התא ההדק מסלולי איתות במורד 15. בפרוטוקול שלנו, אנו השתמשו בשלו…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים מענק (R01 HL086699, HL086699-01A2S1, 1S10RR027327-01) ל-MM. מאמר שלנו נתמך בחלקו על ידי Carl Zeiss MicroImaging LLC.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A7816 |
| Antimycin A | Sigma Aldrich | A8674 |
| DMEM low glucose medium | Invitrogen | 10567-014 |
| Endothelial growth factor supplement (ECGS) | Upstate | 02-102 |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 12662011 |
| G418 | Invitrogen | 10131-027 |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G1393 |
| H2DCFDA | Invitrogen | D-399 |
| LPS | Sigma Aldrich | L4516 |
| LTA | Sigma Aldrich | L2515 |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen | 51985091 |
| Pen/Strep (10x) | Invitrogen | 15140163 |
| pHyPer-cyto | Evrogen | FP941 |
| pHyPer-dMito | Evrogen | FP942 |
| Poly(I:C) | Sigma Aldrich | P0913 |
| Prism software 5.0 | GraphPad Software, Inc. | |
| SigmaPlot 11.0 | Systat software, Inc. | |
| Trypsin-EDTA (10x) | Invitrogen | 15400054 |
| T-25 Flasks | Corning | 430639 |
| T-75 Flasks | BD Falcon | 353136 |
| 96-well TC micro well plate | BD Falcon | 353072 |
| Zen 2009 software | Carl Zeiss 510 Meta confocal microscopy |
References
- Madesh, M. Selective role for superoxide in InsP3 receptor-mediated mitochondrial dysfunction and endothelial apoptosis. J. Cell. Biol. 170, 1079-1090 (2005).
- Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol. Rev. 82, 47-95 (2002).
- Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes. Trends Biochem. Sci. 35, 505-513 .
- Hawkins, B. J. S-glutathionylation activates STIM1 and alters mitochondrial homeostasis. J. Cell. Biol. 190, 391-405 (2010).
- Madesh, M., Hajnoczky, G. VDAC-dependent permeabilization of the outer mitochondrial membrane by superoxide induces rapid and massive cytochrome c release. J. Cell Biol. 155, 1003-1015 (2001).
- Finkel, T., Holbrook, N. J. Oxidants oxidative stress and the biology of ageing. Nature. 408, 239-247 (2000).
- Rittirsch, D., Flierl, M. A., Ward, P. A. Harmful molecular mechanisms in sepsis. Nat. Rev. Immunol. 8, 776-787 (2008).
- Sanlioglu, S. Lipopolysaccharide induces Rac1-dependent reactive oxygen species formation and coordinates tumor necrosis factor-alpha secretion through IKK regulation of NF-kappa. 276, 30188-30198 (2001).
- Hawkins, B. J., Madesh, M., Kirkpatrick, C. J., Fisher, A. B. Superoxide flux in endothelial cells via the chloride channel-3 mediates intracellular signaling. Mol. Biol. Cell. 18, 2002-2012 (2007).
- Vliet, A. v. a. n. d. e. r. NADPH oxidases in lung biology and pathology: host defense enzymes and more. Free Radic. Biol. Med. 44, 938-955 (2008).
- Babior, B. M., Kipnes, R. S., Curnutte, J. T. Biological defense mechanisms. The production by leukocytes of superoxide, a potential bactericidal agent. J. Clin. Invest. 52, 741-744 (1973).
- Lambeth, J. D. NOX enzymes and the biology of reactive oxygen. Nat. Rev. Immunol. 4, 181-189 (2004).
- Mukhopadhyay, P. Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy. Nat. Protoc. 2, 2295-2301 (2007).
- Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459, 996-999 (2009).
- Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity. Nat. Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).
