Visualización de Ca Vascular 2 + Señalización desencadenada por paracrina derivados ROS
Summary
Un método eficaz para obtener información sobre la visualización de la inducción paracrina derivados de ROS endotelial Ca2 + de señalización se describe. Este método tiene la ventaja de medir paracrina derivados ROS provocó la movilización de Ca2 + en las células endoteliales vasculares en un modelo de co-cultivo.
Abstract
El estrés oxidativo ha sido implicado en una serie de condiciones patológicas incluyendo el daño por isquemia / reperfusión y la sepsis. El concepto de estrés oxidativo se refiere a la formación aberrante de los ROS (especies reactivas de oxígeno), que incluye O 2 • -, H 2 O 2, y los radicales hidroxilo. Especies reactivas de oxígeno influye en multitud de procesos celulares, como la transducción de señales, la proliferación celular y muerte celular 1-6. ROS tienen el potencial de daño vascular y las células de órganos directamente, y puede iniciar reacciones químicas secundarias y las alteraciones genéticas que en última instancia, dar lugar a una amplificación de la lesión tisular mediada por ROS inicial. Un componente clave de la cascada de amplificación que agrava el daño irreversible del tejido es el reclutamiento y activación de células inflamatorias circulantes. Durante la inflamación, las células inflamatorias producen citoquinas tales como factor de necrosis tumoral α (TNF) y que la IL-1activan las células endoteliales (CE) y las células epiteliales y además aumentar la respuesta inflamatoria 7. La disfunción del endotelio vascular es una característica establecida de la inflamación aguda. Macrófagos contribuyen a la disfunción endotelial durante la inflamación por mecanismos que no están claros. La activación de los resultados de los macrófagos en la liberación extracelular de O 2 • – y varias citoquinas pro-inflamatorias, lo que desencadena la señalización patológica de las células adyacentes 8. NADPH oxidasas son la fuente principal y primordial de ROS en la mayoría de los tipos de células. Recientemente, se muestra por nosotros y otros 9,10 que ROS producido por NADPH oxidasas inducir la producción mitocondrial de ROS durante muchas condiciones fisiopatológicas. Por lo tanto la medición de la producción mitocondrial de ROS es igual de importante, además de medir citosólica ROS. Los macrófagos producen ROS por la NADPH oxidasa flavoproteína enzima que juega un papel primordial en la inflamación. Una vez activado,NADPH oxidasa fagocítica produce grandes cantidades de O 2 • – que son importantes en el mecanismo de defensa del huésped 11,12. Aunque paracrina derivados de O 2 • – juega un papel importante en la patogénesis de las enfermedades vasculares, la visualización de paracrinos ROS inducida por la señalización intracelular, incluyendo la movilización de Ca 2 + sigue siendo hipótesis. Hemos desarrollado un modelo en el que los macrófagos activados se utilizan como fuente de O 2 • – la transducción de una señal a las células endoteliales adyacentes. El uso de este modelo se demuestra que los macrófagos derivados de O 2 • – llevar a la señalización del calcio en las células endoteliales adyacentes.
Protocol
Discussion
El método aquí descrito permite una medición rápida y cuantitativa de las especies reactivas del oxígeno en las células vivas, ya sea usando tintes sensibles a la oxidación o los sensores de plásmido. Los agonistas de los TLR (Toll-like receptors) son compuestos que estimulan a las células a través de los TLR en la superficie celular y la activación de las vías de señalización hacia abajo 15. En nuestro protocolo, se utilizaron tres diferentes TLR es decir agonistas, Lipo-teicoicos ácido TLR2 a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención (R01 HL086699, HL086699-01A2S1, 1S10RR027327-01) a MM. Nuestro artículo es apoyado en parte por Carl Zeiss MicroImaging LLC.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A7816 |
| Antimycin A | Sigma Aldrich | A8674 |
| DMEM low glucose medium | Invitrogen | 10567-014 |
| Endothelial growth factor supplement (ECGS) | Upstate | 02-102 |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 12662011 |
| G418 | Invitrogen | 10131-027 |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G1393 |
| H2DCFDA | Invitrogen | D-399 |
| LPS | Sigma Aldrich | L4516 |
| LTA | Sigma Aldrich | L2515 |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen | 51985091 |
| Pen/Strep (10x) | Invitrogen | 15140163 |
| pHyPer-cyto | Evrogen | FP941 |
| pHyPer-dMito | Evrogen | FP942 |
| Poly(I:C) | Sigma Aldrich | P0913 |
| Prism software 5.0 | GraphPad Software, Inc. | |
| SigmaPlot 11.0 | Systat software, Inc. | |
| Trypsin-EDTA (10x) | Invitrogen | 15400054 |
| T-25 Flasks | Corning | 430639 |
| T-75 Flasks | BD Falcon | 353136 |
| 96-well TC micro well plate | BD Falcon | 353072 |
| Zen 2009 software | Carl Zeiss 510 Meta confocal microscopy |
References
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