Détermination de radeaux lipidiques partitionnement de sondes par fluorescence-marqués dans les cellules vivantes par spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS)

Résumé

Une technique pour sonder le cloisonnement radeau lipidique des protéines fluorescentes à la membrane plasmique de cellules vivantes est décrite. Il tire profit de la disparité des temps de diffusion des protéines situées à l'intérieur ou à l'extérieur des radeaux lipidiques. L'acquisition peut être effectuée de manière dynamique dans des conditions de contrôle ou après l'addition de drogues.

Résumé

Au cours des quinze dernières années la notion que les membranes cellulaires ne sont pas homogènes, et s'appuyer sur des microdomaines à exercer leurs fonctions est désormais largement admis. Les radeaux lipidiques sont des microdomaines membranaires enrichis en cholestérol et en sphingolipides. Ils jouent un rôle dans les processus physiologiques cellulaires tels que la signalisation, et de ^1,2 le trafic, mais sont également pensés pour être des acteurs clés dans plusieurs maladies dont les infections virales ou bactériennes et les maladies neurodégénératives ^3.

Pourtant, leur existence est encore un sujet de controverse ^4,5. En effet, la taille radeau lipidique a été estimé à environ 20 nm ^6, loin sous la limite de résolution du microscope conventionnel (environ 200 nm), les empêchant ainsi de l'imagerie directe. Jusqu'à présent, les principales techniques utilisées pour évaluer la partition de protéines d'intérêt à l'intérieur de radeaux lipidiques étaient membranes résistant aux détergents (DRM) d'isolement et de co-patching avec des anticorps. Bien que largement utilisé becal'utilisation de leur mise en œuvre assez facile, ces techniques étaient enclins à des artefacts et donc critiqué ^7,8. Les améliorations techniques sont donc nécessaires pour surmonter ces objets et d'être en mesure de sonder lipidique des radeaux de partition dans les cellules vivantes.

Nous présentons ici une méthode pour l'analyse sensible de lipides radeaux partition de protéines par fluorescence-étiquetés ou des lipides dans la membrane plasmique des cellules vivantes. Cette méthode, appelée spectroscopie par corrélation de fluorescence (FCS), repose sur la disparité des temps de diffusion de sondes fluorescentes situées à l'intérieur ou à l'extérieur des radeaux lipidiques. En fait, comme en témoignent les deux membranes artificielles et des cultures cellulaires, les sondes serait de diffuser beaucoup plus rapidement en dehors qu'à l'intérieur des radeaux lipidiques denses ^9,10. Pour déterminer des temps de diffusion, minute fluctuations de fluorescence sont mesurées en fonction du temps dans un volume focal (environ 1 femtolitre), situé à la membrane plasmique de cellules avec un microscope confocal (fig.1). Les courbes d'auto-corrélation peut alors être tirée de ces fluctuations et équipé des modèles appropriés de diffusion mathématiques ^11.

FCS peut être utilisé pour déterminer le radeau lipidique de cloisonnement de sondes différentes, tant qu'ils sont marquées par fluorescence. Fluorescente marquage peut être obtenue par expression de protéines de fusion fluorescentes ou par liaison de ligands fluorescents. Par ailleurs, FCS peut être utilisé non seulement dans des membranes artificielles et des lignées cellulaires, mais aussi dans des cultures primaires, tel que décrit récemment ^12. Il peut également être utilisé pour suivre la dynamique de la séparation des lipides radeau après l'addition de drogues ou de changements dans la composition des lipides membranaires ^12.

Protocole

1. Calibrage de l'installation de FCS

1. Démarrez le microscope confocal, les lasers, les ordinateurs, un incubateur pour la température et le CO ₂ de contrôle.
2. Assurez-vous que le SPAD (Single Photon Avalanche Diode) est allumé et le filtre de fluorescence à l'intérieur du SPAD est bien adapté à votre échantillon. Vérifiez que le SPAD est synchronisé dans le temps. Attention à ne lancer votre logiciel FCS fois vos paramètres SPAD sont prêts pour l'acquisition.
3. Préparer une solution fraîche de la toxine cholérique Alexa488 dilué dans du PBS pour atteindre une concentration de 1 pg / ml (17,5 nM).
4. Optimiser imagerie con....

Discussion

La méthode présentée ici permet de FCS une analyse sensible et rapide de la répartition des lipides radeau de sondes fluorescentes d'intérêt dans les cellules vivantes. FCS combine la précision de la localisation de la microscopie confocale avec la sensibilité de comptage de photon unique. La principale différence entre FCS et standards techniques biochimiques, c'est que FCS permet la détermination absolue de lipides radeaux de la partition de la cible et non pas la partition relative comme c'est le cas pour.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Sous-unité toxine B du choléra-Alexa 488	Invitrogen	C-34775	MW (pentamère) = 57 kg / mol
Microscope confocal	Leica	SP5
Incubateur pour la température et le CO 2 de contrôle	La vie des services d'imagerie	Le Cube et la boîte de
SPAD (Single Photon Avalanche Diode)	MPD (Micro Devices Photon)	PDM série (100 um zone sensible)
Passe-haut 488 nm filtre	Semrock	488 nm de blocage de bord Brightline filtre passe-long N ° de pièceails.aspx? id = FF01-488/LP-25 "target =" _blank "> FF01-488/LP-25
Unité de détection de FCS	Picoquant	Picoharp 300 modules
Acquisition et d'auto-corrélation de logiciels	Picoquant	SymPhoTime
Logiciel de montage	OriginLab	OriginPro8