Imagen confocal espectral de marcado con fluorescencia receptores nicotínicos en Knock-en ratones con administración crónica de nicotina

Summary

Hemos desarrollado una nueva técnica para cuantificar los cambios de los receptores nicotínicos de acetilcolina en las regiones subcelulares de los subtipos específicos de neuronas del sistema nervioso central para comprender mejor los mecanismos de la adicción a la nicotina mediante el uso de una combinación de enfoques que incluyen el etiquetado proteína fluorescente del receptor con el golpe-en el enfoque y espectral imagen confocal.

Abstract

Ligando los canales iónicos en el sistema nervioso central (SNC) están implicados en numerosas enfermedades con graves consecuencias médicas y sociales. Por ejemplo, la adicción a la nicotina a través de consumo de tabaco es la principal causa de muerte prematura en todo el mundo (Organización Mundial de la Salud) y es probablemente causado por una alteración de la distribución de canales de iones en el cerebro ^1. La exposición crónica de nicotina en roedores y en los resultados de los seres humanos en un mayor número de receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChR) en el tejido cerebral ^1-3. Del mismo modo, las alteraciones en los glutamatérgicos GluN1 o GluA1 canales han sido implicados en el desencadenamiento de la sensibilización a otras drogas adictivas como la cocaína, las anfetaminas y los opiáceos ^4-6.

En consecuencia, la capacidad de asignar y cuantificar los patrones de distribución y expresión de canales iónicos específicos es de vital importancia para la comprensión de los mecanismos de la adicción. El estudio de la región del cerebro específica de EFpermiten descomponer los medicamentos individuales fue promovido por el advenimiento de técnicas tales como ligandos radiactivos. Sin embargo, la baja resolución espacial de la unión del ligando radiactivo impide la capacidad de cuantificar ligando los canales iónicos en los subtipos específicos de neuronas.

Codificados genéticamente reporteros fluorescentes, como la proteína verde fluorescente (GFP) y sus variantes de color muchas, han revolucionado el campo de la biología ^7. Mediante el etiquetado de un reportero genéticamente fluorescente a una proteína endógena se puede visualizar las proteínas in vivo ^10.7. Una de las ventajas de las proteínas de marcado con fluorescencia con una sonda es la eliminación del uso de anticuerpos, que tienen problemas de falta de especificidad y la accesibilidad a la proteína diana. Hemos utilizado esta estrategia para nAChRs etiqueta fluorescente, lo que permitió el estudio de conjunto de los receptores con transferencia de energía Förster resonancia (FRET) transfectadas en células cultivadas ^11. Más recientemente, se ha utilizado el Knock-en el enfoque de los ratones de ingeniería con proteína amarilla fluorescente etiquetado a4 subunidades de nAChR (α4YFP), lo que permite la cuantificación precisa de la ex vivo del receptor a una resolución de submicrométrico en las neuronas del SNC a través de la microscopía confocal espectral ^12. El selectivo fluorescente en cadena en la mutación se incorpora en el locus endógeno y bajo el control de su promotor nativo, produciendo niveles normales de expresión y regulación del receptor cuando se compara a los receptores no marcados en ratones normales. Este enfoque knock-in puede ser extendido para marcar con fluorescencia de otros canales de iones y ofrece un enfoque de gran alcance de la visualización y cuantificación de los receptores en el SNC.

En este trabajo se describe una metodología para cuantificar los cambios en la expresión de nAChR en las neuronas del SNC específicos después de la exposición crónica a la nicotina. Nuestros métodos incluyen mini-osmótica implantación de la bomba, la fijación de perfusión intracardíaca, las imágenes y el análisis de fluorescencia rec etiquetado nicotínicosubunidades eptor de α4YFP en cadena en ratones (fig. 1). Hemos optimizado la técnica de fijación para minimizar autofluorescencia de tissue.We cerebro fijo describir en detalle nuestra metodología de imágenes utilizando un microscopio confocal espectral en conjunción con un algoritmo de desmezcla espectral lineal para restar la señal autofluoresent con el fin de obtener con precisión la señal de fluorescencia α4YFP. Finalmente, se muestran los resultados de la crónica inducida por la nicotina regulación al alza de los receptores de α4YFP en la vía perforante medial del hipocampo.

Protocol

1. Bomba de la implantación Antes de la implantación de la bomba, rellenar y preparar a los Alzet bombas mini-osmóticas (Alzet, modelo 2002, de Cupertino, EE.UU.), teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire. Este modelo de mini-osmótica bomba suministra solución a una velocidad de 0,5 l / h durante 14 días. Asegúrese de que las condiciones de esterilidad. Pesar las bombas vacías y llenas. A la conclusión del experimento (10 días después de la implantación), el líquido residual en la bomba…

Discussion

<p class="jove_content"> El uso de un receptor fluorescente en un modelo de ratón knock-in para determinar la cantidad y localización de un canal iónico específico proporciona una serie de ventajas. En contraste a las proteínas como la actina, que se expresa de forma ubicua en todas las células, los canales iónicos están presentes en un número mucho menor y su expresión varía entre los subtipos neuronales que hacen un análisis preciso a través de tradicionales técnicas de inmunohistoquímica difíciles. El producto del gen α4Y…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
mini-osmotic pumps	Alzet	model 2002
saline	Teknova	S5819
(-)-nicotine hydrogen tartrate salt	Sigma	N5260
eye drops	Novartis	Tear-Gel
Vetbond glue	3M	1469SB
heparin sodium salt	Sigma	H4784
10x PBS	Invitrogen	70011
ketamine	Wyeth Animal Health	0856-4403-01
medatomidine hydrochloride	Pfizer	1950673
23G butterfly needle	Becton Dickinson	367253
paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
plastic embedding mold	VWR	18986-1
O.C.T. Mounting Compound	Tissue-Tek	4583
Mowiol 4-88	EMD-Calbiochem	475904	pH 8.5