Spectral konfokale Bildgebung von fluoreszenzmarkierten Nikotinrezeptoren in Knock-in Mäusen mit chronischer Gabe von Nikotin
Summary
Wir haben eine neue Technik zur Quantifizierung nikotinergen Acetylcholin-Rezeptors Veränderungen innerhalb subzellulären Regionen spezifischen Subtypen von ZNS-Neuronen zum besseren Verständnis der Mechanismen der Nikotinabhängigkeit, indem eine Kombination von Ansätzen einschließlich fluoreszierendes Protein Markierung des Rezeptors mit dem Knock-in-Ansatz entwickelt und spektrale konfokale Bildgebung.
Abstract
Liganden-gesteuerte Ionenkanäle im zentralen Nervensystem (ZNS) werden in zahlreichen Bedingungen mit schweren medizinischen und sozialen Folgen verwickelt. So ist zum Beispiel Sucht nach Nikotin über das Rauchen eine der häufigsten Ursachen für vorzeitigen Tod weltweit (World Health Organization) und wird wahrscheinlich durch eine Veränderung der Ionenkanal-Verteilung im Gehirn 1 verursacht. Chronische Nikotin bei Nagern und Menschen führt zu einer erhöhten Anzahl von nikotinischen Acetylcholinrezeptoren (nAChR) im Hirngewebe 1-3. Ebenso haben Veränderungen in den glutamatergen GluN1 oder GluA1 Kanäle bei der Auslösung von Sensibilisierung mit anderen süchtig machenden Drogen wie Kokain, Amphetamine und Opiate 4-6 in Verbindung gebracht.
Folglich ist die Fähigkeit zu erfassen und zu quantifizieren, Verteilung und Expressionsmuster von spezifischen Ionenkanäle von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Mechanismen der Sucht. Das Studium der Hirnregion-spezifische efgen von einzelnen Drogen wurde durch das Aufkommen von Techniken wie der radioaktiven Liganden vorangetrieben. Jedoch verhindert die geringe räumliche Auflösung des radioaktiven Liganden-Bindung in der Lage, Liganden-gesteuerte Ionenkanäle in spezifischen Subtypen von Neuronen zu quantifizieren.
Genetisch kodierte fluoreszierende Reporter, wie grün fluoreszierende Protein (GFP) und seine vielen Farbvarianten, revolutioniert haben das Feld der Biologie 7. Durch gentechnisch Tagging einen fluoreszierenden Reporter an ein endogenes Protein ein Protein in vivo 10.07 visualisieren können. Ein Vorteil der Fluoreszenz-Tagging Proteine mit einer Sonde ist die Beseitigung von Antikörper Verwendung, die Probleme der Nichtspezifizität und Zugänglichkeit an das Zielprotein aufweisen. Wir haben diese Strategie, um Fluoreszenz-Label nAChRs, das die Studie von Rezeptor-Montage mit Förster Resonance Energy Transfer (FRET) in transfizierten Kulturzellen 11 aktiviert werden. In jüngerer Zeit haben wir die knoc verwendetk-Ingenieur in Annäherung an Mäusen, die mit gelb fluoreszierenden Protein markiert α4 nAChR-Untereinheiten (α4YFP), ermöglicht eine präzise Quantifizierung der Rezeptor ex vivo bei Sub-Mikrometer-Auflösung in ZNS-Neuronen über spektrale konfokale Mikroskopie 12. Die gezielte fluoreszierende Knock-in-Mutation befindet sich im endogenen Locus und unter Kontrolle seines nativen Promotors eingebaut, wodurch ein normales Niveau der Expression und Regulation des Rezeptors, wenn um den unmarkierten Rezeptoren in Wildtyp-Mäusen verglichen. Das Knock-in-Ansatz kann erweitert werden, fluoreszierend markieren andere Ionenkanäle werden und bietet eine leistungsfähige Methode zur Visualisierung und Quantifizierung von Rezeptoren im ZNS.
In diesem Beitrag beschreiben wir eine Methode, um Veränderungen in der nAChR-Expression in spezifischen ZNS-Neuronen nach der Exposition mit chronischem Nikotin zu quantifizieren. Unsere Methoden sind mini-osmotischen Pumpe Implantation, intrakardiale Perfusionsfixierung, Abbildung und Analyse von fluoreszenzmarkierten Nikotinsäure receptor Untereinheiten aus α4YFP knock-in Mäuse (Abb. 1). Wir haben die Verfahren zur Fixierung optimiert, um Autofluoreszenz von festen Gehirn tissue.We minimieren beschreiben im Detail unsere Methode Bildgebung unter Verwendung einer spektralen konfokalen Mikroskop in Verbindung mit einem linearen Entmischung Algorithmus autofluoresent Signal zu subtrahieren, um genau zu erhalten α4YFP Fluoreszenzsignals. Schließlich zeigen wir Ergebnisse von chronischem Nikotin-induzierte Hochregulation von α4YFP Rezeptoren im medialen perforans des Hippocampus.
Protocol
Discussion
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Anthony Renda wurde von einem University of Victoria Graduate Fellowship Award unterstützt. Myre und Winifred Sim Fund, einer kanadischen Stiftung für Innovation Finanzhilfe, wird British Columbia Knowledge Development Fund – Diese Arbeit wurde von einem Natural Sciences and Engineering Research Council von Kanada Discovery Grant, ein NARSAD Young Investigator Award (bis RN), eine Victoria-Stiftung unterstützt und ein Natural Sciences and Engineering Research Council von Kanada Research Tools und Instrumentation Grant. Wir danken Jillian McKay, Christina Barnes, Ariel Sullivan, Jennifer MacDonald und Daniel Morgado für exzellente Maus Tierhaltung.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| mini-osmotic pumps | Alzet | model 2002 | |
| saline | Teknova | S5819 | |
| (-)-nicotine hydrogen tartrate salt | Sigma | N5260 | |
| eye drops | Novartis | Tear-Gel | |
| Vetbond glue | 3M | 1469SB | |
| heparin sodium salt | Sigma | H4784 | |
| 10x PBS | Invitrogen | 70011 | |
| ketamine | Wyeth Animal Health | 0856-4403-01 | |
| medatomidine hydrochloride | Pfizer | 1950673 | |
| 23G butterfly needle | Becton Dickinson | 367253 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| plastic embedding mold | VWR | 18986-1 | |
| O.C.T. Mounting Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Mowiol 4-88 | EMD-Calbiochem | 475904 | pH 8.5 |
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