Spectrale confocale beelden van de fluorescent gelabeld nicotinereceptoren in de knock-in muizen met chronische Nicotine Administratie
Summary
We hebben een nieuwe techniek van het kwantificeren van nicotine acetylcholine receptor veranderingen binnen subcellulaire regio's van specifieke subtypes van CNS neuronen beter de mechanismen van de nicotine verslaving te begrijpen met behulp van een combinatie van benaderingen waaronder fluorescerend eiwit tagging van de receptor met behulp van de knock-in aanpak en spectrale confocale beeldvorming.
Abstract
Ligand-gated ionkanalen in het centrale zenuwstelsel (CZS) zijn betrokken bij tal van aandoeningen met ernstige medische en sociale gevolgen. Bijvoorbeeld, de verslaving aan nicotine via het roken van tabak is een belangrijke oorzaak van vroegtijdig overlijden wereldwijd (World Health Organization) en wordt waarschijnlijk veroorzaakt door een wijziging van ionkanaal distributie in de hersenen 1. Chronische blootstelling aan nicotine in zowel knaagdieren als mensen resulteert in een verhoogd aantal nicotine acetylcholine receptoren (nAChRs) in het hersenweefsel 1-3. Ook hebben veranderingen in de glutamaterge GluN1 of GluA1 kanalen zijn betrokken bij het ontstaan van overgevoeligheid voor andere verslavende drugs zoals cocaïne, amfetamines en opiaten 4-6.
Bijgevolg is de mogelijkheid om in kaart te brengen en te kwantificeren distributie en expressie patronen van specifieke ionkanalen is van cruciaal belang voor het begrijpen van de mechanismen van verslaving. De studie van de hersenen regiospecifieke effecten van individuele geneesmiddelen werd voorgeschoten door de komst van technieken zoals radioactieve liganden. De lage ruimtelijke resolutie van radioactieve ligand verhindert de aan ligand ionen kanalen kwantificeren specifieke subtypen van neuronen.
Genetisch gecodeerd fluorescerende verslaggevers, zoals groen fluorescerend eiwit (GFP) en de vele kleur varianten, hebben een revolutie teweeggebracht op het gebied van de biologie 7. Door genetisch tagging een tl-reporter is een endogeen eiwit kan men eiwitten visualiseren in vivo 7-10. Een voordeel van fluorescent tagging eiwitten met een sonde is de eliminatie van antilichaam gebruik, die vraagstukken van nonspecificity en de toegankelijkheid van het doelwit eiwit hebben. We hebben gebruik gemaakt van deze strategie om fluorescent label nAChRs, die de studie van receptor montage met behulp van Förster Resonance Energy Transfer (FRET) in getransfecteerde gekweekte cellen 11 ingeschakeld. Meer recent hebben we de knoc gebruiktk-in benadering van de ingenieur muizen met geel fluorescerend eiwit gelabeld α4 nAChR subeenheden (α4YFP), om een nauwkeurige kwantificering van de receptor ex vivo bij submicrometer resolutie in CNS neuronen via spectrale confocale microscopie 12. De beoogde fluorescerende knock-in mutatie is opgenomen in de endogene locus en onder controle van de oorspronkelijke promotor, de productie van normale niveaus van expressie en regulatie van de receptor in vergelijking met niet-gecodeerde receptoren in wildtype muizen. Deze knock-in benadering kan worden uitgebreid tot fluorescent label andere ionkanalen en biedt een krachtige aanpak van het visualiseren en kwantificeren van receptoren in het CZS.
In dit artikel beschrijven we een methode om veranderingen in de nAChR expressie te kwantificeren in specifieke CNS neuronen na blootstelling aan chronische nicotine. Onze methoden zijn onder andere mini-osmotische pomp implantatie, intracardiale perfusie fixatie, beeldvorming en analyse van fluorescent gelabeld nicotinezuur receptor subunits uit α4YFP knock-in muizen (afb. 1). We hebben geoptimaliseerd fixatie techniek autofluorescentie minimaliseren van vaste hersenen tissue.We in detail onze imaging methode met een spectrale confocale microscoop in combinatie met een lineaire spectrale ontmenging algoritme autofluoresent signaal aftrekken om nauwkeurig verkrijgen α4YFP fluorescentiesignaal beschrijven. Tot slot tonen we de resultaten van chronische nicotine geïnduceerde opregulatie van α4YFP receptoren in de mediale perforant pad van de hippocampus.
Protocol
Discussion
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Anthony Renda werd ondersteund door een universiteit van Victoria Graduate Fellowship Award. Dit onderzoek werd ondersteund door een natuur-en ingenieurswetenschappen Research Council of Canada Discovery Grant, een NARSAD Young Investigator Award (tot RN), een Victoria Foundation – Myre en Winifred Sim Fonds, een Canadese Stichting voor Innovatie subsidie, een Brits Columbia Kennis Ontwikkelingsfonds en een natuur-en ingenieurswetenschappen Research Council van Canada Research Tools and Instrumentation Grant. Wij danken Jillian McKay, Christina Barnes, Ariel Sullivan, Jennifer MacDonald en Daniel Morgado voor een uitstekende muis veeteelt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| mini-osmotic pumps | Alzet | model 2002 | |
| saline | Teknova | S5819 | |
| (-)-nicotine hydrogen tartrate salt | Sigma | N5260 | |
| eye drops | Novartis | Tear-Gel | |
| Vetbond glue | 3M | 1469SB | |
| heparin sodium salt | Sigma | H4784 | |
| 10x PBS | Invitrogen | 70011 | |
| ketamine | Wyeth Animal Health | 0856-4403-01 | |
| medatomidine hydrochloride | Pfizer | 1950673 | |
| 23G butterfly needle | Becton Dickinson | 367253 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| plastic embedding mold | VWR | 18986-1 | |
| O.C.T. Mounting Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Mowiol 4-88 | EMD-Calbiochem | 475904 | pH 8.5 |
References
- Perry, D. C., Davila-Garcia, M. I., Stockmeier, C. A., Kellar, K. J. Increased nicotinic receptors in brains from smokers: membrane binding and autoradiography studies. J. Pharmacol. Exp. Ther. 289, 1545-1552 (1999).
- Schwartz, R. D., Kellar, K. J. Nicotinic cholinergic receptor binding sites in the brain: regulation in vivo. Science. 220, 214-216 (1983).
- Marks, M. J., Burch, J. B., Collins, A. C. Effects of chronic nicotine infusion on tolerance development and nicotinic receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 226, 817-8125 (1983).
- Carlezon, W. A. J., Nestler, E. J. Elevated levels of GluR1 in the midbrain: a trigger for sensitization to drugs of abuse. Trends Neurosci. 25, 610-615 (2002).
- Fitzgerald, L. W., Ortiz, J., Hamedani, A. G., Nestler, E. J. Drugs of abuse and stress increase the expression of GluR1 and NMDAR1 glutamate receptor subunits in the rat ventral tegmental area: common adaptations among cross-sensitizing agents. J. Neurosci. 16, 274-2782 (1996).
- Saal, D., Dong, Y., Bonci, A., Malenka, R. C. Drugs of abuse and stress trigger a common synaptic adaptation in dopamine neurons. Neuron. 37, 577-5782 (2003).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Nashmi, R., Dickinson, M. E., McKinney, S., Jareb, M., Labarca, C., Fraser, S. E. Assembly of α4β2 nicotinic acetylcholine receptors assessed with functional fluorescently labeled subunits: effects of localization, trafficking, and nicotine-induced upregulation in clonal mammalian cells and in cultured midbrain neurons. J. Neurosci. 23, 11554-11567 (2003).
- Nashmi, R., Xiao, C., Deshpande, P., McKinney, S., Grady, S. R., Whiteaker, P. Chronic nicotine cell specifically upregulates functional α4* nicotinic receptors: basis for both tolerance in midbrain and enhanced long-term potentiation in perforant path. J. Neurosci. 27, 8202-8218 (2007).
- Dickinson, M. E., Bearman, G., Tilie, S., Lansford, R., Fraser, S. E. Multi-spectral imaging and linear unmixing add a whole new dimension to laser scanning fluorescence microscopy. BioTechniques. 31, 1272-1278 (2001).
- Nashmi, R., Fraser, S. E., Lester, H., Dickinson, M. E., Periasamy, A., Day, R. N. . Molecular imaging: fret microscopy and spectroscopy. , 180-192 (2005).
- Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Lett. 531, 245-249 (2002).
- Larson, J. M. The Nikon C1si combines high spectral resolution, high sensitivity, and high acquisition speed. Cytometry A. 69, 825-8234 (2006).
- Melvin, N. R., Sutherland, R. J. Quantitative caveats of standard immunohistochemical procedures: implications for optical disector-based designs. J. Histochem. Cytochem. 58, 577-5784 (2010).
- Jones, I. W., Wonnacott, S. Why doesn’t nicotinic ACh receptor immunoreactivity knock out. Trends Neurosci. 28, 343-345 (2005).
- Moser, N., Mechawar, N., Jones, I., Gochberg-Sarver, A., Orr-Urtreger, A., Plomann, M. Evaluating the suitability of nicotinic acetylcholine receptor antibodies for standard immunodetection procedures. J. Neurochem. , (2007).
- Whiteaker, P., Cooper, J. F., Salminen, O., Marks, M. J., McClure-Begley, T. D., Brown, R. W., Collins, A. C., Lindstrom, J. M. Immunolabeling demonstrates the interdependence of mouse brain a4 and b2 nicotinic acetylcholine receptor subunit expression. The Journal of Comparative Neurology. 499, 1016-1038 (2006).
- Marks, M. J., McClure-Begley, T. D., Whiteaker, P., Salminen, O., Brown, R. W. B., Cooper, J., Collins, A. C., Lindstrom, J. M. Increased nicotinic acetylcholine receptor protein underlies chronic nicotine-induced up-regulation of nicotinic agonist binding sites in mouse brain. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. , 337-3187 (2011).
- Marks, M. J., Rowell, P. P., Cao, J. Z., Grady, S. R., McCallum, S. E., Collins, A. C. Subsets of acetylcholine-stimulated 86[Rb]+ efflux and 125[I]-epibatidine binding sites in C57BL/6 mouse brain are differentially affected by chronic nicotine treatment. Neuropharmacology. 46, 1141-1157 (2004).
- King, S. L., Caldarone, B. J., Picciotto, M. R. Beta2-subunit-containing nicotinic acetylcholine receptors are critical for dopamine-dependent locomotor activation following repeated nicotine administration. Neuropharmacology. 47, 132-139 (2004).
- Robinson, S. F., Marks, M. J., Collins, A. C. Inbred mouse strains vary in oral self-selection of nicotine. Psychopharmacology (Berl). 124, 332-339 (1996).
- Sparks, J. A., Pauly, J. R. Effects of continuous oral nicotine administration on brain nicotinic receptors and responsiveness to nicotine in C57Bl/6 mice. Psychopharmacology (Berl). , 141-145 (1999).
- Rahman, S., Zhang, J., Engleman, E. A., Corrigall, W. A. Neuroadaptive changes in the mesoaccumbens dopamine system after chronic nicotine self-administration: a microdialysis study. Neurosciences. 129, 415-4124 (2004).
- Picciotto, M. R., Zoli, M., Rimondini, R., Lena, C., Marubio, L. M., Pich, E. M. Acetylcholine receptors containing the β2 subunit are involved in the reinforcing properties of nicotine. Nature. 391, 173-177 (1998).
- Fowler, C. D., Lu, Q., Johnson, P. M., Marks, M. J., Kenny, P. J. Habenular α5 nicotinic receptor subunit signalling controls nicotine intake. Nature. 471, 597-601 (2011).
- Maskos, U., Molles, B. E., Pons, S., Besson, M., Guiard, B. P., Guilloux, J. P. Nicotine reinforcement and cognition restored by targeted expression of nicotinic receptors. Nature. 436, 103-107 (2005).
- Matta, S. G., Balfour, D. J., Benowitz, N. L., Boyd, R. T., Buccafusco, J. J., Caggiula, A. R., Craig, C. R., Collins, A. C., Damaj, M. I., Donny, E. C., Gardiner, P. S., Grady, S. R., Heberlein, U., Leonard, S. S. Guidelines on nicotine dose selection for in vivo research. Psychopharmacology. 190, 269-319 (2007).
- Lang, T., Rizzoli, S. O. Membrane protein clusters at nanoscale resolution: more than pretty pictures. Physiology (Bethesda). 25, 116-1124 (2010).
