Efficienti di produzione Parvovirus ricombinante con l'aiuto delle Adenovirus sistemi derivati
Summary
Qui si descrive un protocollo basato solo sulle infezione delle cellule, che migliora l'efficienza della produzione di parvovirus ricombinante di oltre 100 volte in confronto ad altri protocolli in uso. Questo protocollo si basa sull'utilizzo di un adenovirus nuovo 5-helper base contenente la VP parvovirus unità di trascrizione (Ad-VP).
Abstract
Parvovirus roditori (PV) come H-rat 1PV e MVM, sono piccoli icosaedrica, virus a singolo filamento di DNA. La loro genoma comprende due promotori P4 e P38 che regolano l'espressione di proteine non strutturali (NS1 e NS2) e capside (VP1 e VP2) rispettivamente 1. Attirano grande interesse come agenti antitumorali per le loro capacità e oncolitici oncosuppressive pur essendo non patogeno per gli esseri umani 2. NS1 è l'effettore maggiore di 3 citotossicità virale. Per migliorare ulteriormente le attività antineoplastici naturali, derivati da questi vettori sono stati generati sostituendo il gene che codifica per le proteine del capside di un transgene terapeutico (ad esempio un polipeptide citotossico, citochine, chemochine, gene soppressore del tumore, ecc) 4. I parvovirus ricombinanti (recPVs) vettore mantiene le NS1 / 2 e le sequenze codificanti telomeri genoma PV che sono necessari per l'amplificazione del DNA virale e confezionamento. ProduzionerecPVs verifica solo nelle cellule produttrici (generalmente HEK293T) mediante co-trasfezione delle cellule con un vettore secondo (pCMV-VP) che esprime il gene che codifica per le proteine VP (Fig. 1) 4. I vettori recPV generati in questo modo sono replica difettosi. Anche se recPVs dimostrato di possedere attività oncotoxic avanzate rispetto ai virus parentali da cui sono stati generati, la loro produzione resta una sfida importante e ostacola fortemente l'uso di questi agenti in applicazioni cliniche anti-cancro.
Abbiamo trovato che l'introduzione di un vettore Ad-5 derivata contenente il E2a, E4 (ORF6) ed i geni RNA VA (es pXX6 plasmide) in HEK293T migliorato la produzione di recPVs di oltre 10 volte in confronto ad altri protocolli in uso. Sulla base di questa scoperta, abbiamo costruito un nuovo Ad-VP-helper che contiene gli elementi necessari genomici adenovirali per aumentare la produzione recPVs nonché la parvovirci VP gene unità 5. L'uso di Ad-VP-helper, consente la produzione di racco-PV utilizzando un protocollo che si basa interamente su gradini infezione virale (al contrario di trasfezione plasmide), rendendo possibile l'uso di linee cellulari che sono difficili da trasfettare (es NB324K) ( Fig. 2). Presentiamo un metodo che migliora notevolmente la quantità di virus ricombinante prodotto, riducendo sia i tempi e costi di produzione, senza compromettere la qualità del prodotto finale 5. Inoltre, la produzione su larga scala di recPV (in cellule in sospensione e bioreattori) è concepibile.
Protocol
Discussion
Abbiamo dimostrato che la produzione recPV può essere migliorata dalla presenza di elementi genomiche adenovirali. Abbiamo aumentato i rendimenti recPV da più di 10 volte (0,3-5 TU / cellula) fornendo genomico elemento adenovirus tramite trasfezione e da più di 100 volte co-infettando le cellule con Ad-VP-helper in combinazione con la recPV in rispetto ai protocolli convenzionali. Il protocollo qui descritto può essere ulteriormente ottimizzato determinando il tempo più appropriata per la fornitura di elementi geno…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il team di produzione del virus DKFZ e unità di sviluppo, in particolare Marco Müller, Silvia Münstermann, Barbara Liebetrau e Mandy Roscher. Questo studio è stato in parte sostenuto da finanziamenti del Ministero federale dell'Istruzione e della Ricerca (BMBF) e l'Associazione Helmholtz nel quadro del Krebsforschungszentrum Deutsches / CANCEROPOLE du Grand-Est programma comune tumore Virologia Applicata.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM | Sigma | D5796 |
| MEM | Sigma | M4655 |
| Foetal Bovine Serum | PAA | A15-101 |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-024 |
| Fugene | Roche | 047097050001 |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300062 |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263 |
| Adeno-X Rapid Titer Kit | Clontech | 632250 |
References
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