두 분자가 상호 작용하는 세포의 표면에 고정하는 경우 수용체 – 리간드 상호 작용 속도론을 측정하는 접착 주파수 분석이 설명되어 있습니다. 이 기계 기반의 분석은 수용체와 리간드를 상호 작용으로 micropipette – 압력 인간의 붉은 부착 센서와 같은 혈액 세포와 인테 αLβ2과 세포 유착 분자 – 1을 사용하여 exemplified입니다.
micropipette 부착 분석은 2 차원 (2D) 수용체 – 리간드 바인딩 속도론 1 측정하기 위해 1998 년에 개발되었습니다. 분석은 부착 센서와 상호 작용하는 분자 중 하나를 제시 세포로 인간의 적혈구 (RBC)를 사용합니다. 그것은 정확하게 제어 영역과 결합 형성을 활성화하기 위해 시간과 다른 상호 작용하는 분자를 표현 다른 세포와 접촉에 RBC를 가지고 미세 조작을 사용합니다. 접착 이벤트가 떨어져 두 세포를 당기시 RBC의 신장으로 감지됩니다. RBC 표면에 고정화 리간드의 밀도를 조절하여 접착의 확률은 0과 1 사이의 미드 레인지에 보관됩니다. 유착 확률은 주어진 접촉 시간이 두 세포 사이의 접촉 반복주기의 순서에 유착 사건의 주파수 추정된다. 연락처 시간을 변화하는 것은 바인딩 커브를 생성합니다. 바인딩 수용체 – 리간드 반응 속도론 1 확률적 모델 피팅곡선은 2D 친화력과 오프 속도를 반환합니다.
분석은 IgG FC 1-6 glycoconjugate 리간드 6-9, 리간드 10-13, homotypical cadherin 구속력이 14 펩타이드 – 주요 histocompatibility의 단지 15 T 세포 수용체와 coreceptor과 integrins와 selectins과 Fcγ 수용체의 상호 작용을 사용하여 검증되었습니다 – 19.
방법은, 같은 멤브레인 microtopology 5, 멤브레인 앵커 2, 분자 오리 엔테이션 및 길이 6, 캐리어 강성 9, 곡률 20과 충돌 힘 20,뿐만 아니라 생화 학적 요인 biophysical 요소에 의해 2D 속도론의 규정을 계량하는 데 사용되었습니다 상호 작용하는 분자가있는 cytoskeleton과 멤브레인 microenvironment하고 이러한 분자 15,17,19의 표면 조직의 모듈 레이터 등.
방법은 t에도 사용되고 있습니다O는 수정된 모델 21를 사용하여 이중 수용체 – 리간드 종 3,4의 동시 구속, 19 trimolecular 상호 작용을 공부합니다.
방법의 주요 장점은 자신의 기본 멤브레인 환경에서 수용체 연구를 허용한다는 것입니다. 결과는 정화 수용체 17를 사용하여 얻은 이들의 매우 다른 수 있습니다. 또한 잘 전형적인 생화학 방법을 넘어 시간적 해상도를 가진 하위 초 timescale에있는 수용체 – 리간드 상호 작용의 연구를 수 있습니다.
micropipette 부착 주파수 방법을 설명하기 위해, 우리는 α L의 β 2 활성화 솔루션에 dimeric E – selectin과 neutrophils에서 인테 그린 α L의 β 2 구속력 RBCs에 작용 세포 유착 분자 1 (ICAM – 1)의 속도론 측정을 보여줍니다.
성공적으로 한 몇 가지 중요한 단계를 고려해야합니다 micropipette 부착 주파수 분석을 사용합니다. 첫째, 관심의 수용체 – 리간드 시스템의 구체적인 상호 작용을 기록해야합니다. 특이 현상이 제어 측정 (그림 참조하라. 3, 4)는 특이성을 보장합니다. 이상적으로, 특이 현상이 부착 확률은 접촉 시간에 대한 기간이 0.05 이하이어야하며 각 시점에 대한 구체적이고 특이 현상이 부착 확률 사이의 상당?…
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 NIH 보조금 R01HL091020, R01HL093723, R01AI077343 및 R01GM096187 지원했다.
Name of the reagent | Company | Catalogue # | Comments |
---|---|---|---|
10x PBS | BioWhittaker | 17-517Q |
Dilute to 1x with deionized water prior to use |
Vacutainer EDTA | BD | 366643 | RBCs isolation |
10ML PK100 | |||
Histopaque 1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | RBCs isolation |
Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | EAS-45 preparation |
D-glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | EAS-45 preparation |
D-Mannitol | Sigma-Aldrich | 6360 | EAS-45 preparation |
Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | EAS-45 preparation |
Sodium Phosphate, Dibasic (Na₂HPO₄) | Fisher Scientific | S374 | EAS-45 preparation |
L-glutamine | Sigma-Aldrich | G5763 | EAS-45 preparation |
Biotin-X-NHS | Calbiochem | 203188 | RBCs biotinylation |
Dimethylformamide (DMF) | Thermo Scientific | 20673 | RBCs biotinylation |
Borate Buffer (0.1M) | Electron Microscopy Sciences | 11455-90 | RBCs biotinylation |
Streptavidin | Thermo Scientific | 21125 | Ligand functionalizing |
BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalizing |
Quantibrite PE Beads | BD Biosciences | 340495 | Density quantification |
Flow cytometer | BD Immunocytometry Systems | BD LSR II |
Density quantification |
Capillary Tube 0.7-1.0mm x 30" |
Kimble Glass Inc. | 46485-1 | Micropipette pulling |
Mineral Oil | Fisher Scientific | BP2629-1 | Chamber assembly |
Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-G | Chamber assembly |
PE α-human CD11a Clone HI 111 |
eBioscience | 12-0119-71 | Reagent for Fig.1 |
PE anti-human CD54 | eBioscience | 12-0549 | Reagent for Fig.1 |
Mouse IgG1 Isotype Control PE | eBioscience | 12-4714 | Reagent for Fig.1 |
hydraulic micromanipulator | Narishige | MO-303 | Micropipette system |
Mechanical manipulator | Newport | 461-xyz-m, SM-13, DM-13 | Micropipette system |
piezoelectric translator | Physik Instrumente | P-840 | Micropipette system |
LabVIEW | National Instruments | Version 8.6 | Micropipette system |
DAQ board | National Instruments | USB-6008 | Micropipette system |
Optical table | Kinetics Systems | 5200 Series | Micropipette system |