En este artículo se describe el uso de pinzas magnéticas para estudiar el efecto de la fuerza en la proteólisis enzimática a nivel sola molécula de una manera altamente paralelizable.
La generación y detección de las fuerzas mecánicas es un aspecto omnipresente de la fisiología celular, con relación directa con la metástasis del cáncer 1, 2 y aterogénesis cicatrización de la herida 3. En cada uno de estos ejemplos, las células tanto de ejercer la fuerza de su entorno y al mismo tiempo enzimáticamente remodelación de la matriz extracelular (MEC). El efecto de las fuerzas de ECM se ha convertido en un área de considerable interés debido a su probable importancia biológica y médica 4-7.
Técnicas de una sola molécula, tales como la captura óptica 8, microscopía de fuerza atómica 9, y pinzas magnéticas 10,11 permitirá a los investigadores para probar la función de las enzimas a nivel molecular, al ejercer fuerzas sobre las proteínas individuales. De estas técnicas, pinzas magnéticas (MT) se caracterizan por su bajo costo y alto rendimiento. MT ejercen fuerzas en el rango de 1-100 ~ pN y puede proporcionar milisegundo resolución temporal,cualidades que son bien emparejados para el estudio del mecanismo de la enzima en el nivel de una sola molécula de 12. Aquí mostramos un ensayo altamente paralelizable MT para estudiar el efecto de la fuerza en la proteólisis de las moléculas de proteínas individuales. Se presenta el ejemplo específico de la proteolisis de un péptido de colágeno trimérica por metaloproteinasas de matriz 1 (MMP-1), sin embargo, este ensayo se puede adaptar fácilmente para estudiar otros sustratos y proteasas.
Este protocolo se describe un nuevo uso para una sola molécula técnica clásica. Pinzas magnéticas permiten a medio y alto rendimiento de los ensayos de una sola molécula de una manera costo-eficiente. Sin embargo, como todas las técnicas experimentales que hay desafíos y peligros potenciales.
Limitaciones de pinzas magnéticas
En comparación con una trampa óptica de la resolución espacial y temporal de un aparato de TA es baja. Por otra parte, las fuerzas …
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por el premio a la Trayectoria Burroughs Wellcome en la interfaz de la Ciencia (ARD), los Institutos Nacionales de Salud a través de Nuevo Director del NIH Programa Premio a la Innovación 1-DP2-OD007078 (ARD), el William Bowes, Jr. Stanford Graduate Fellowship (ASA ), y el Instituto Cardiovascular de Stanford beca predoctoral Joven (JC). Los autores agradecen a James Spudich por el préstamo de equipos de microscopía.
Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
Micro Cover Glass #1.5 (22×22) | VWR | 48366-067 |
Micro Cover Glass #1.5 (22×40) | VWR | 48393-048 |
Lambda DNA | Invitrogen | 25250-010 |
T4 DNA Ligase | Invitrogen | 15224-041 |
Microcon Ultracel YM-100 | Millipore | 42413 |
Anti-Digoxigenin | Roche Diagnostics | 11-333-089-001 |
Tween 20 | Sigma | P9416-100ML |
Anti-myc Antibody | Invitrogen | 46-0603 |
Bovine Serum Albumin | Sigma | B4287-5G |
Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D |
Dynabeads MyOne T1 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D |
p-Aminophenylmercuric Acetate | Calbiochem | 164610 |
Biotin-Maleimide | Sigma Aldrich | B1267 |
Biotin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis |
Digoxigenin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis |
Collagen peptide gene | DNA 2.0 | Custom synthesis |
MMP-1 cDNA | Harvard Plasmid Database | |
z-translator | Thorlabs | MTS50 |
Servo controller for translator | Thorlabs | TDC001 |